黃瓜花葉病毒2b蛋白與擬南芥核輸入蛋白alpha的互作研究.pdf

1、黃瓜花葉病毒(CMV)是一種經(jīng)濟(jì)重要性植物病原，而且，該病毒越來(lái)越多地被作為模式病毒用于病毒與寄主的互作研究。CMV基因組由3條單鏈正義RNA組成，共編碼5種蛋白。其中，由RNA2的亞基因組RNA4A編碼產(chǎn)生的2b蛋白，是一個(gè)多功能蛋白。CMV2b蛋白能有效地抑制小RNA介導(dǎo)的RNA沉默和水楊酸介導(dǎo)的CMV抗性。此外，CMV2b蛋白在病毒的致病性和病毒在植物體內(nèi)的長(zhǎng)距離的移動(dòng)扮演重要的角色。CMV2b蛋白由于其編碼1個(gè)（亞組Ⅱ株系）或2

2、個(gè)（亞組Ⅰ株系）核定位信號(hào)(NLS)而定位于細(xì)胞核。至今，介導(dǎo)CMV2b蛋白核輸入的分子機(jī)制仍未闡明。
　　核蛋白進(jìn)入細(xì)胞核主要通過(guò)核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Karyopherin或Importin）alpha/beta途徑。作為模式植物擬南芥，共編碼9種Importin alpha蛋白（IMPa1-9）。那么，CMV2b蛋白是否通過(guò)與Importin alpha互作進(jìn)入細(xì)胞核？為回答這個(gè)問(wèn)題，首先，本論文通過(guò)常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增獲得擬南芥IM

3、Pa1-9編碼序列;其次，通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)沒(méi)有檢測(cè)到IMPa1-9蛋白與CMV2b蛋白的互作;為了進(jìn)一步證實(shí)IMPa與CMV2b蛋白的互作情況，我們利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)在植物體內(nèi)檢測(cè)擬南芥IMPa1-9與CMV2b蛋白的互作，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IMPa2、IMPa3和IMPa6與CMV2b蛋白發(fā)生互作;進(jìn)而，我們利用重疊PCR技術(shù)將CMV2b蛋白NLS1和NLS2序列替換為丙氨酸(A)，最終構(gòu)建兩個(gè)單突變體Fny2bNLS1-

4、6A-YFPC、Fny2bNLS2-4A-YFPC以及雙突變體Fny2bNLS1,2-6A，4A-YFPC，利用BiFC檢測(cè)這三種突變體與IMPa2、IMPa3和IMPa6的互作。熒光觀察結(jié)果顯示:除Fny2bNLS2-4A-YFPC與IMPa3共表達(dá)呈現(xiàn)弱熒光信號(hào)之外，其它均沒(méi)有檢測(cè)至到熒光信號(hào)。這說(shuō)明NLS1和NLS2是CMV2b蛋白與IMPa2和IMPa6的互作所必需的，IMPa3則很可能是通過(guò)識(shí)別NLS1與Fny2b蛋白發(fā)生互作

5、。再者，我們通過(guò)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)將GFP-2b與IMPa2、IMPa3或IMPa6進(jìn)行瞬時(shí)共表達(dá)。熒光觀察結(jié)果顯示:IMPa2的瞬時(shí)表達(dá)顯著增強(qiáng)CMV2b蛋白的細(xì)胞核積累;而且，二者的共表達(dá)導(dǎo)致浸潤(rùn)葉組織的壞死表型。之后，利用擬南芥突變體測(cè)試IMPa蛋白對(duì)CMV癥狀產(chǎn)生的影響。本實(shí)驗(yàn)利用2b蛋白高度核定位的CMV突變體Fny-CMV2bNLS進(jìn)行病毒侵染實(shí)驗(yàn)，該病毒侵染野生型擬南芥導(dǎo)致系統(tǒng)葉的嚴(yán)重壞死。癥狀觀察結(jié)果顯示:與野生型的擬南芥植物比

6、較，在擬南芥impa2突變體表現(xiàn)的壞死表型顯著減弱。這些結(jié)果都說(shuō)明CMV2b蛋白的細(xì)胞核定位很可能與IMPa2蛋白的互作有關(guān);最后，我們通過(guò)GFP融合，觀察IMPa2、IMPa3和IMPa6在細(xì)胞中的亞細(xì)胞分布。結(jié)果表明:與對(duì)照GUS-GFP相比，三者均有不同程度的細(xì)胞核積累。其中，IMPa2主要定位于細(xì)胞核。
　　綜上所述，通過(guò)本論文的研究，我們初步確定亞組Ⅰ株系CMV編碼的2b蛋白與擬南芥IMPa2、IMPa3和IMPa6三者