黃瓜花葉病毒外殼蛋白與番茄光合作用相關蛋白的互作研究.pdf

1、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是雀麥花葉病毒科黃瓜花葉病毒屬病毒典型代表種，其外殼蛋白(Coat protein，CP)位于病毒粒子的最外層，與病毒的胞間運輸和長程運輸、蚜蟲傳播等密切相關，是CMV重要的癥狀決定因子。光合作用是綠色植物最重要的生理生化活動之一，主要由葉綠體蛋白控制和調節(jié)。植物病毒的侵染通常導致植物葉綠體損傷和葉綠體蛋白的功能失調。深入理解和研究病毒蛋白-葉綠體蛋白的相互作用，對揭示植

2、物病毒致病機理和植物抗病毒機制具有重要意義。
　　本實驗室的前期研究以CMV CP為誘餌從番茄cDNA文庫中大規(guī)模篩選到9個與CMV CP互作的光合作用相關蛋白，本研究選取其中6個蛋白基因進行進一步驗證，主要研究成果如下:
　　以健康番茄總RNA為模板，通過RT-PCR方法克隆6個候選基因的完整編碼區(qū)(CDS)，構建pPR3-N-目的基因的獵物載體，分別與CMV CP誘餌表達載體共同轉化酵母菌株NMY51，涂布于不同的營養(yǎng)缺

3、陷型選擇培養(yǎng)基平板，結果顯示，在酵母菌中，二磷酸核酮糖羧化酶小亞基2a小鏈(rbcs2a)（克隆編號E104）、二磷酸核酮糖羧化酶小亞基3b小鏈(rbcs3b)（克隆編號B3）、光系統(tǒng)Ⅱ10KDa多肽PsbR（克隆編號E57）、光系統(tǒng)Ⅱ中心復合體蛋白psbY（克隆編號E161）與CMV CP存在相互作用，而光系統(tǒng)Ⅱ中心復合體蛋白PsbW（克隆編號D15）和原葉綠素酸脂酸脂質還原酶（克隆編號D68)與CMV CP不存在相互作用。
　

4、　分別構建CMV CP及在酵母菌中與CMV CP互作的4個光合作用相關基因的雙分子熒光互補載體YN-CMV CP和YC-B3、YC-E57、YC-E104、YC-E161，將含有YN-CMV CP的農(nóng)桿菌菌液與分別含有YC-B3、YC-E57、YC-E104、YC-E161的農(nóng)桿菌菌液共同注射煙草，激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示所有處理均可發(fā)出黃色熒光，說明在煙草葉片中CMV CP與上述四個蛋白互作，與酵母雙雜交的結果一致。
　　初

5、步確定CMV CP與互作蛋白的互作功能域。將CMV CP基因序列分成三段:1-327bp(CMV CP-1)、163-489bp(CMV CP-2)、328-654bp(CMVCP-3)分別構建雙分子熒光互補載體，即YN-CMV CP-1、YN-CMV CP-2、YN-CMV CP-3，分別與YC-B3、YC-E57、YC-E104、YC-E161轉化農(nóng)桿菌注射煙草，，激光共聚焦顯微鏡觀察，結果顯示:YN-CMV CP-1、2、3+ Y

6、C-B3，YN-CMV CP-1、3+YC-E57, YN-CMV CP-1、2、3+YC-E104, YN-CMV CP-1、2+ YC-E161有黃色熒光;YN-CMV CP-2+ YC-E57，YN-CMV CP-3+ YC-E161無黃色熒光。表明CMV CP具有多個與寄主蛋白的互作位點，且CMV CP與不同的寄主蛋白互作位點不同。
　　為進一步分析CMV CP與B3、E57、E104、E161的互作位點，通過同源建模軟件