黃瓜花葉病毒基因組表達與寄主microRNA的相關性研究.pdf

1、近年來，病毒的發(fā)生日益猖獗，其對社會和人類造成的危害也不斷加重，在突發(fā)性流行的病毒中，大部分都是(+)RNA病毒。人們對該類病毒已有一定的認識，它們具有簡單的分子組成和結構，基因組RNA具有mRNA的功能，直接指導蛋白質的合成。然而，由于目前該類病毒的復制和致病機理還不清楚，使得我們對在面臨病毒爆發(fā)時常常十分被動，對病害進行控制和治療時也往往束手無策。其中，缺少高效、可靠、靈敏的實驗手段對病毒基因表達的時序變化規(guī)律進行全程監(jiān)控，是制約我

2、們深入認識該類病毒的瓶頸之一。
　　 黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是目前世界上發(fā)生最普遍和危害最嚴重的植物病毒，也是在中國研究最多的植物病毒之一。作為典型的多分體(+)RNA病毒，其具有三條基因組RNA(RNA1、RNA2、RNA3)和兩條亞基因組(RNA4、RNA4A)。在寄主體內，負責CMV復制、移動、包裝、致病性等的5種必需蛋白的含量，分別由單獨由一條基因組/亞基因組的表達量決定。因此

3、，對不同感染時期、不同致病條件下、不同寄主組織中病毒各基因組的表達量變化進行監(jiān)測，探索寄主癥狀的發(fā)生與病毒各基因組的消長關系，將為我們認識CMV的復制和致病機理，研究環(huán)境、寄主和病毒三者之間的關系，尋找應對該類病毒的控制和治療方法開創(chuàng)新天地。
　　 microRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于真核生物中、長度21-24 nt的單鏈小RNA分子。近年來，越來越多的研究表明，miRNAs在植物基因表達調控、病毒一寄主的互作過程

4、中起非常重要的作用。然而，由于其分子小，并且某些miRNAs只在特定細胞、特定內外因素誘導下瞬時表達，還有些miRNAs的表達量很低，傳統(tǒng)的核酸分析方法很難做到高靈敏度和高特異性，迫切需要高靈敏度、高特異性和高通量的定性/定量檢測方法，幫助我們進一步深入研究miRNAs的分子和細胞調控功能。
　　 隨著科學技術的不斷發(fā)展，新興的實驗方法和手段為上述問題的解決開辟了新途徑。熒光定量PCR和基因芯片是近年來發(fā)展起來的新技術，基于其在

5、基因定量和定性分析方面高通量、高效率的特點，它們在分子生物學上的應用日益廣泛，在基因表達、核酸定量分析等方面的重要作用日益顯現(xiàn)。本論文就熒光定量PCR和基因芯片技術在黃瓜植物病毒基因組RNAs的時序表達和寄主miRNAs對病毒侵染的響應研究方面，進行了以下工作：
　　 1.在國際上首次建立了對多分體(+)RNA病毒的各基因組進行絕對/相對定量分析的實驗體系。首次利用SYBR Green I熒光定量RT-PCR，確定了CMV病毒粒

6、子中RNA1、RNA2、RNA3和RNA4的絕對拷貝數(shù)分別為(4.47±0.5)x107、(4.87±0.33)x107、(5.57±0.25)x107、(1.60±0.09)x108和(4.20±0.11)x108 copies/μl，對應其比例為RNAl:2：3：4=1.00:1.17(±0.11):3.58(±0.20):5.81(±0.31)。并利用Northem雜交和Lab-on-a-Chip對該實驗結果進行了驗證。與常規(guī)的R

7、NA定量分析體系相比較，熒光定量RT-PCR具有較高的靈敏度和準確性。此外，以18S rRNA為內參照，建立了對寄主組織中CMV各基因組/亞基因組表達量的時序變化進行相對定量分析的實驗體系，分析了致弱/非致弱衛(wèi)星RNA對輔助病毒各基因組表達量的影響。初步探討了寄主癥狀的改變與CMV各基因組以及衛(wèi)星RNA表達量變化之間的關系。
　　 2.優(yōu)化了熒光定量RT-PCR實驗數(shù)據(jù)處理過程。目前，熒光定量PCR技術所面臨的最突出問題是實驗數(shù)

8、據(jù)龐大、分析困難，另外定量結果存在誤差、不夠準確，主要原因是數(shù)據(jù)處理方法導致的。針對這些問題，我們拓展了前人的研究，將CF值(calibration factor，熒光信號與DNA分子之間的相關系數(shù))的計算引入最新發(fā)展起來的幾種實驗數(shù)據(jù)處理方法中，用Fo(第0個循環(huán)的熒光值)代替Ct值，對5種CMV病毒粒子中各個基因組RNA用不同方法分別進行絕對定量分析。其中LinReg PCR(線性回歸PCR)方法以操作簡單、計算方便、定量結果準確顯

9、示出更好的優(yōu)越性。在此基礎上，我們提出了應用該方法對不同基因的含量進行絕對/相對定量分析的簡便計算公式，使得基因間的相對量比較更加簡捷方便。
　　 3.設計合成了植物miRNAs檢測和表達分析芯片，補充了數(shù)據(jù)庫中番茄miRNAs及其靶標mRNAs的序列信息，并分析了不同病毒侵染對寄主番茄miRNAs表達的影響。利用植物miRNAs的保守性，根據(jù)數(shù)據(jù)庫中已有物種的UniquemiRNA的序列信息，設計合成了植物miRNAs檢測和表

10、達分析芯片。應用該芯片，在健康、感病的番茄葉組織中共檢測到25個家族的105條UIuque miRNA的雜交信號。與Mock比較，病毒侵染后，共引起番茄89條miRNA發(fā)生了差異性表達，并且不同病毒對番茄miRNAs表達圖譜的影響各異，暗示他們通過不同的方式干擾miRNAs的表達。據(jù)我們所知，這是目前番茄miRNA對病毒侵染響應的最廣泛的一次分析，將為病毒致病機理、病毒與寄主互作的研究提供了新的分子信息和理論依據(jù)。
　　 4.首

11、次建立了植物miRNAs莖環(huán)結構熒光定量RT-PCR定量分析體系。根據(jù)芯片雜交結果，篩選出了與病毒侵染密切相關的植物miRNAs。然后利用3'-RACE的方法，克隆出部分miRNAs的靶標mRNAs序列。最后，借鑒并拓展人類及動物組織中miRNAs的研究，針對miRNAs長度小的特點，設計了莖環(huán)結構的反轉錄引物(stem-loop RT primer)。并以染料代替探針，首次利用熒光定量RT-PCR，特異性的檢測了病毒侵染對番茄葉組織中