黃瓜花葉病毒侵染與煙草細(xì)胞自噬相關(guān)性的研究.pdf

1、細(xì)胞自噬(Autophagy)是真核細(xì)胞中一種高度保守的降解細(xì)胞組分的生理過程，在應(yīng)對營養(yǎng)缺失、疾病、衰老等方面發(fā)揮重要作用。細(xì)胞自噬與病毒互作成為近年來的研究熱點(diǎn)，目前煙草上三大主要病毒中，普通煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)與煙草細(xì)胞自噬的相關(guān)性已有研究，而關(guān)于黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)侵染煙草對細(xì)胞自噬的調(diào)

2、控顯見報(bào)道。因此，為明確黃瓜花葉病毒CMV是否能夠引起細(xì)胞自噬，本文對CMV和煙草細(xì)胞自噬的相關(guān)性進(jìn)行了研究。
　　為方便準(zhǔn)確檢測煙草的細(xì)胞自噬，本研究首先構(gòu)建了青色熒光標(biāo)記(cyan fluorescence protein，CFP)與煙草細(xì)胞自噬標(biāo)志基因ATG8f相融合的轉(zhuǎn)基因植株Nb-CFP-ATG8f通過缺C或缺N實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)植株產(chǎn)生細(xì)胞自噬，驗(yàn)證了Nb-CFP-ATG8f能夠穩(wěn)定有效表達(dá)CFP，可作為監(jiān)測煙草細(xì)胞自噬的研究材

3、料。以CMV和Nb-CFP-ATG8f為主要實(shí)驗(yàn)材料，利用激光共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM)、透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy，TEM)、Western Blot技術(shù)和熒光定量PCR(qRT-PCR)方法，分析CMV侵染對煙草細(xì)胞自噬流、細(xì)胞自噬顯微結(jié)構(gòu)，以及自噬相關(guān)蛋白LC3(ricrotubule-associated p

4、roteinllight chain3，LC3)、P62(ubiqutin-binding protein，P62)和自噬相關(guān)基因表達(dá)特征的影響。結(jié)果表明:
　　1、激光共聚焦結(jié)果顯示，與PBS處理的對照植株相比，CMV侵染后可在葉片中觀察到明顯的青色熒光標(biāo)記的自噬體。電鏡結(jié)果進(jìn)一步顯示，CMV侵染后葉片細(xì)胞內(nèi)線粒體、葉綠體、細(xì)胞核膜等細(xì)胞器出現(xiàn)不同程度的破壞和降解，細(xì)胞空泡化現(xiàn)象嚴(yán)重，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)微自噬和巨自噬結(jié)構(gòu)。表明CMV

5、侵染引起煙草能夠引起寄主的細(xì)胞器降解，并誘發(fā)細(xì)胞自噬。
　　2、同時(shí)利用Western Blot對細(xì)胞自噬兩大標(biāo)記蛋白LC3和P62的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，隨著CMV侵染時(shí)間增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，而P62表達(dá)水平正好呈現(xiàn)相反趨勢，隨著自噬發(fā)生其表達(dá)量降低。證明CMV侵染煙草可以引起相關(guān)蛋白表達(dá)量變化，誘發(fā)寄主細(xì)胞自噬。
　　3、為進(jìn)一步驗(yàn)證CMV侵染對寄主細(xì)胞自噬信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控，本研究利用qRT-PC

6、R對CMV侵染脅迫下煙草細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了定量檢測，結(jié)果表明，CMV侵染后0h、24h、48h、72h、96h和120h，CMV病毒表達(dá)量持續(xù)增加，細(xì)胞自噬相關(guān)基因NtATG1a、NtATG1b、NtATG3、NtATG4、NtATG8a、NtATG8b、NtATG8c、NtATG8d、NtATG9、NtATG10、NtATG13a、NtATG13b、NtATG18a、NtATG18c、NtATG18d、NtATGVTL12、