黃瓜花葉病毒2b蛋白的致病性及其與病毒適應(yīng)性的關(guān)系.pdf

1、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)2b蛋白是由其基因組RNA2的亞基因組RNA4A在寄主體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生，扮演致病因子、RNA沉默抑制子和病毒長距離移動決定因子的角色。2b蛋白致病性的體現(xiàn)幾乎停留在寄主表觀癥狀的描述，未曾從內(nèi)在特征對其致病性進(jìn)行深入分析。為此，本論文首先從寄主葉綠體結(jié)構(gòu)和光合特征的角度探索2b蛋白的致病性。通過構(gòu)建2b蛋白不表達(dá)的突變體Fny-CMV△2bpro，并與其野生病毒Fny-CMV進(jìn)行

2、平行比較，結(jié)果顯示：Fny-CMV侵染的心葉煙(Nicotianaglutinosa)植株表現(xiàn)重花葉、畸形和矮化癥狀，植株的光合速率和葉綠素含量顯著降低，葉綠體形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯病變。但是，F(xiàn)ny-CMV△2bpro侵染的心葉煙植株在系統(tǒng)葉上僅表現(xiàn)輕微花葉或不明顯癥狀；與健康對照相比，其光合速率和葉綠素含量沒有顯著差異，葉綠體形態(tài)和結(jié)構(gòu)亦未出現(xiàn)明顯病變。由此可見，2b蛋白的表達(dá)導(dǎo)致葉綠體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的破壞、光合速率的降低和葉綠素含量的下降

3、。 CMV亞組IA株系或亞組II株系編碼產(chǎn)生的2b蛋白均表明為病毒的致病決定因子。在此，我們對CMV亞組IB株系編碼的2b基因的致病性進(jìn)行分析。將CMV亞組IV分離物Cb7-CMV、Na-CMV、Rad35-CMV和PGs-CMV的2bORF精確替換Fny-CMV的2bORF，分別產(chǎn)生以Fny-CMV作為遺傳背景的4株2b基因種內(nèi)雜交病毒FCb72b-CMV、FNa2b-CMV、FRad352b-CMV和FPGs2b-CMV。生

4、物學(xué)實驗結(jié)果表明：FCb72b-CMV與其親本病毒Cb7-CMV在測試的心葉煙、普通煙(Nicotianatabacum)和本生煙(Nicotianabenthamiana)上有著相似的生物學(xué)表型，比Fny-CMV表現(xiàn)更強(qiáng)的致病性；FNa2b-CMV在這些測試寄主上也表現(xiàn)高致病性，相同于其親本病毒Fny-CMV和Na-CMV;然而，F(xiàn)Rad352b-CMV僅引起輕花葉或不明顯癥狀，其致病性遠(yuǎn)低于其親本病毒Fny-CMV和Rad35-CM

5、V；FPGs2b-CMV能系統(tǒng)侵染以上3種煙草測試寄主，產(chǎn)生花葉或不明顯癥狀，這說明PGs-CMV分離物不能系統(tǒng)侵染煙草寄主不是由其2b蛋白引起。通過間接方法確定種內(nèi)雜交病毒的不同致病性是由其編碼的2b蛋白引起，而非2a蛋白的C端重疊部分；并且，致病性高低與病毒子代RNA在系統(tǒng)葉中的積累水平相關(guān)，與病毒在寄主體內(nèi)的長距離移動速率無關(guān)。 在以上研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過Fny-CMV與FPGs2b-CMV、Fny-CMV與FNa2b-

6、CMV、FRad352b-CMV與FPGs2b-CMV三對組合按照不同的比例在心葉煙體內(nèi)進(jìn)行競爭，分析編碼不同2b基因的病毒的適應(yīng)性選擇。結(jié)果顯示：FNa2b-CMV和Fny-CMV二者在心葉煙寄主體內(nèi)有著同等的適應(yīng)性；Fny-CMV在心葉煙上比FPGs2b-CMV具有絕對的適應(yīng)性優(yōu)勢；然而，F(xiàn)PGs2b-CMV與FRad352b-CMV相比，在心葉煙體內(nèi)占據(jù)相對的適應(yīng)性優(yōu)勢。以上結(jié)果說明病毒在寄主體內(nèi)的適應(yīng)性與2b蛋白介導(dǎo)的致病性有關(guān)

7、。FPGs2b-CMV和Fny-CMV△2bpro二者在心葉煙體內(nèi)的競爭說明了Fny-CMV和FPGs2b-CMV的適應(yīng)性差異是由它們的2b蛋白引起，而非2b核苷酸序列或2a蛋白導(dǎo)致。 最后，我們從單細(xì)胞復(fù)制水平和細(xì)胞間擴(kuò)散速率兩個方面分析Fny-CMV和FPGs2b-CMV之間的差異。我們發(fā)現(xiàn)Fny-CMV和FPGs2b-CMV二者在心葉煙原生質(zhì)體內(nèi)有著同等的復(fù)制水平；但是，F(xiàn)ny-CMV在心葉煙接種葉上的細(xì)胞間擴(kuò)散速率顯著高