大花蕙蘭轉(zhuǎn)建蘭花葉病毒與齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因及檢測.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、大花蕙蘭(Cymbidium hybridum)是以蘭科蘭屬植物為親本,通過雜交育種培育成的品種群,具有極高的觀賞價值和重要的經(jīng)濟價值,為五大盆栽蘭花之一,是重要的切花種類之一。近年來,世界多種蘭花的栽培和生產(chǎn)受病毒危害嚴重,其中建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)與齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是造成危害最為嚴重的兩種重要病毒,可導(dǎo)致植株生長不良、

2、花期縮短,開花質(zhì)量和數(shù)量下降,嚴重影響花卉的觀賞價值,制約了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此,培育大花蕙蘭抗病毒新品種已成為育種的主要方向。由于蘭花抗病毒種質(zhì)資源的匾乏,育種周期漫長,導(dǎo)致蘭花抗病毒育種一直處于停滯狀態(tài),基因工程技術(shù)的應(yīng)用為其開辟了一條新的道路。
  本研究對建蘭花葉病毒與齒蘭環(huán)斑病毒的外殼蛋白基因進行了克隆,分別構(gòu)建了2種病毒外殼蛋白基因的pBI121表達載體,采用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介

3、導(dǎo)法對大花蕙蘭進行了轉(zhuǎn)化,獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株。同時,建立靈敏、準確的轉(zhuǎn)基因植株檢測方法。為利用基因工程技術(shù)進行蘭花抗病毒育種提供了參考,為以后的蘭花新品種培育提供了種質(zhì)資源。
  1、本研究克隆了建蘭花葉病毒與齒蘭環(huán)斑病毒兩種病毒的外殼蛋白基因,CymMVCP基因序列和ORSV CP基因序列與NCBI上的基因序列(AB197937,DQ915440)相似度均高達99%。
  2、構(gòu)建了CymMV CP基因與ORSV CP基

4、因的表達載體pBI121-CymMVCP和pBI121-ORSVCP,通過農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)對大花蕙蘭受體材料進行了轉(zhuǎn)化。
  3、以表達載體pBI121-CymMVCP和pBI121-ORSVCP為模板,建立了普通PCR、巢式PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)檢測體系,并對LAMP體系中的dNTPs濃度、內(nèi)外引物的濃度比例和Bst DNA聚合酶加入量等條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:0.5mmol·L-1 dNTPs、

5、0.8μmol·L-1的內(nèi)引物、0.2μmol·L-1的外引物、4 U Bst DNA聚合酶大片段、2.5μL的10×ThermoPol Buffer以及10 ng的質(zhì)粒模板。
  4、以重組表達載體質(zhì)粒作模板,普通PCR,巢式PCR和LAMP的最低檢出濃度分別為5.0×10-4 ng·μL-1,5.0×10-7 ng·μL-1和5.0×10-10 ng·μL-1;結(jié)果表明,巢式PCR方法的靈敏度是普通PCR方法的1000倍左右,

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