干種子中大豆花葉病毒（SMV）和菜豆普通花葉病毒（BCMV）的分子檢測技術(shù)研究.pdf

1、　　本研究以大豆和菜豆種子中主要種傳病毒大豆花葉病毒(SMV)、菜豆普通花葉病毒(BCMV)作為檢測對象，在生物學(xué)測定和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的基礎(chǔ)上，研究干種子中兩種病毒的逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測方法，以建立一套快速、靈敏、專化性強的直接以干種子作為檢測對象的分子檢測技術(shù)體系，主要結(jié)果如下：　　(1)建立了從大豆和菜豆干種子中提取SMV、BCMV總RNA的有效方法。針對不同種子中特有的組成成分及其含量，采用

2、不同的提取方法，對抽提緩沖液的組成及各組分的濃度進行優(yōu)化，去除了雜質(zhì)和PCR反應(yīng)抑制物質(zhì)；同時對一些步驟進行合并重組，縮短了提取時間，建立了從大豆和菜豆干種子中提取SMV、BCMV總RNA的快速、有效的方法?！　?2)構(gòu)建了直接檢測大豆和菜豆干種子中SMV、BCMV的特異性引物。根據(jù)已發(fā)表的SMVG2株系的核苷酸序列(GenBank，№.S42280)和BCMVNL1株系的核苷酸序列(GenBank，№.AY112735)設(shè)計了2對擴

3、增外殼蛋白(CP)基因的特異性寡核苷酸引物，成功應(yīng)用于大豆和菜豆干種子中SMV、BCMV的檢測。　　(3)建立了直接以大豆和菜豆干種子為檢測對象的快速、靈敏、?；詮姷腟MV、BCMV的RT-PCR檢測技術(shù)體系。在提取了高質(zhì)量總RNA的基礎(chǔ)上，應(yīng)用特異性引物，對兩種病毒的RT-PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，成功擴增出了與理論設(shè)計大小一致的核苷酸片段，無非特異性片段出現(xiàn)；為了進一步驗證引物的特異性，將獲得的目的片段進行克隆和序列同源性比較發(fā)現(xiàn)