辣椒煙草花葉病毒的分子鑒定及檢測技術研究.pdf

1、辣椒系茄科辣椒屬一年或有限多年生草本植物，其營養(yǎng)價值極高，堪稱―蔬菜之冠。作為辣椒產銷大省，貴州辣椒常年栽培面積500萬畝左右，約占中國的20％，產值150億左右，其經濟對辣椒產業(yè)的依賴程度有上升之勢。然而，近年來隨著辣椒種質的交流，病毒隨之擴散，并產生越來越嚴重的危害，造成極大的經濟損失。因此，對辣椒病毒病的早期診斷并采取一定的防范措施對減少經濟損失具有重要意義。煙草花葉病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)隸屬于煙

2、草花葉屬（Tobamovirus），為(+)ssRNA病毒，主要通過汁液傳播，病健葉輕微摩擦造成微傷口，病毒即可侵入，對辣椒的危害日益擴大。對植物病毒分離物進行分子鑒定并研究開發(fā)出快速靈敏的檢測方法對病毒病的早期預防具有重要的理論及實踐意義。本研究對采自貴州的辣椒病樣進行了ELISA檢測，對TMV貴州辣椒分離物（TMV-GZ）進行了分子鑒定，建立了同步檢測TMV、PMMoV和CMV三種辣椒重要病毒的多重RT-PCR方法和檢測TMV的核酸

3、斑點雜交方法，同時，建立并優(yōu)化了TMV外殼蛋白（CP）基因的原核表達體系，以期為TMV抗血清的制備及免疫學檢測方法的建立奠定基礎。本研究獲得的主要結論如下：
　　1．成功克隆了TMV-GZ分離物全長CP基因序列，該基因長為480 bp，編碼18 kDa的CP蛋白。TMV-GZ分離物CP基因序列與同屬異種病毒的同源性僅為32%-65%，序列差異明顯；相反，它與11個TMV病毒分離物的同源性在98%-99%之間；TMV及其它病毒分離物

4、聚類形成3個明顯分支，TMV-GZ與其他11個TMV分離物親緣關系較近，而與同屬其他3種病毒之間的進化距離較遠，證實該分離物確為TMV。
　　2．根據煙草花葉病毒(TMV)、辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)和黃瓜花葉病毒(CMV)的外殼蛋白(CP)編碼序列設計了3對PCR檢測引物，通過條件優(yōu)化建立了同步檢測以上3種辣椒病毒的多重RT-PCR方法。該多重 RT-PCR體系不對ORSV、PVX和PVY等同屬或不同屬的其它病毒發(fā)生反應，特異

5、性好；可檢測到104×稀釋的病毒cDNA模板，具有較高的靈敏度，可用于PMMoV、TMV和CMV3種辣椒病毒的同步檢測。
　　3.基于TMV的CP序列，采用隨機引物法制備了地高辛標記的TMV雙鏈cDNA雜交探針（DIG-TMV CP），并初步建立了快速檢測TMV的核酸斑點雜交（NASH）方法，該法具有較好的特異性和靈敏度（可檢測到625×稀釋的病毒RNA）。
　　4.構建了TMV CP基因的原核表達載體pET32a_TMV