抗煙草花葉病毒海洋細(xì)菌的分離鑒定及發(fā)酵產(chǎn)物的活性.pdf

1、海洋微生物用于抗病毒方面的研究不多，特別抗植物病毒的研究少見報道。本研究以煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)為靶標(biāo)，利用福建省豐富的海洋資源，獲得具有抗病毒活性的菌株，為微生物農(nóng)藥的研發(fā)提供理論和物質(zhì)支持。 本研究篩選出對煙草花葉病毒(TMV)有抑制作用的6個細(xì)菌菌株。通過初篩重點(diǎn)研究了活性較強(qiáng)的菌株9a和10b：采用半葉法測定對煙草花葉病毒(TMV)的鈍化作用，其抑制率分別達(dá)到95.26％、92.18

2、％；采用圓片法測定對煙草花葉病毒體外抑制增殖作用，抑制率分別為36.1％、35.1％。通過噴施處理，兩菌株培養(yǎng)液可以體內(nèi)抑制TMV增值，抑制率分別是15.18％、39.76％，可以提高過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等防御酶的活性以及葉綠素含量的增加，誘導(dǎo)煙草對TMV的系統(tǒng)侵染產(chǎn)生抗性；兩菌株培養(yǎng)液對侵染位點(diǎn)具有保護(hù)作用，抑制率為62.14％、62.36％。同時兩菌株對蘋果干腐病菌(Botryosphaeriadothidea

3、)、西瓜炭疽菌(Colletetrichumorbiculare)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.)等多種病原真菌具有拮抗作用，在普通光學(xué)顯微鏡觀察下顯示，兩菌株可抑制菌絲生長，造成菌絲分支增多，頂端和中央膨大等畸變。 為了明確兩株細(xì)菌的分類地位，本研究對兩菌株進(jìn)行了生物學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。9a、10b菌株的形態(tài)特性和培養(yǎng)特征及生理生化的性質(zhì)可以初步確定為芽孢桿菌，采用16SrDNA序列分析方法，通過克

4、隆測序獲得16SrDNA基因序列，序列已登錄Genbank，登錄號為DQ432009，DQ432010，利用CLUSTAL、MEGA、在線BLUST等生物信息學(xué)軟件對序列進(jìn)行分析，9a的序列與芽孢桿菌屬中蠟樣芽孢桿菌種(Bacilluscereus)的16SrDNA序列具有很高的同源性，達(dá)到99％；而10b的序列與水生芽孢桿菌(Bacillusaquimaris)的16SrDNA序列具有99％的同源性。因此，從分子角度進(jìn)一步確定9a為海

5、洋蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)，10b為水生芽孢桿菌(Bacillusaquimaris)。 在發(fā)酵液活性初篩的基礎(chǔ)上，選擇菌株9a蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)作為進(jìn)一步研究對象。結(jié)果表明，抗病毒活性部分不能通過有機(jī)溶劑萃取出來。通過硫酸銨鹽析、DEAESepharoseFastFlow離子交換柱層析和SephadexG-50凝膠過濾層析，純化得到一個對TMV侵染具有抑制作用的蛋白，SDS-PAG