香菇多糖的制備及抗煙草花葉病毒(TMV)作用機(jī)制的研究.pdf

1、香菇多糖(Lentinan，β-(1-3)-D-glucan)，廣泛存在于香菇子實(shí)體和菌絲體細(xì)胞壁中，眾多研究表明，其具有降血糖、降血脂、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗病毒等生物學(xué)功能。不同來(lái)源的真菌多糖因其化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子尺寸及鏈構(gòu)象的不同，其生物功能活性存在較大差異。從香菇中有效地提取和純化出高純度多糖，并研究其化學(xué)分子結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系是實(shí)現(xiàn)香菇多糖應(yīng)用價(jià)值的重要步驟。
　　采收后的香菇培養(yǎng)基是香菇栽培的廢棄物，大量廢棄的香菇培養(yǎng)基因缺

2、乏有效的管理和利用，造成水和土壤的污染，還帶來(lái)資源的浪費(fèi)。雖然近年來(lái)國(guó)內(nèi)已將食用菌培養(yǎng)基廢棄物用做食用菌再生產(chǎn)的配料、動(dòng)物飼料、堆肥、栽培基質(zhì)、生態(tài)環(huán)境修復(fù)材料等來(lái)開(kāi)發(fā)利用(Phan and Sabaratnam，2012)，但從留存有大量的菌絲體而富含多糖類(lèi)化合物的香菇培養(yǎng)基廢棄物中提取多糖用作生物農(nóng)藥的研究報(bào)道未見(jiàn)。
　　本文主要以香菇培養(yǎng)基廢棄物為試驗(yàn)材料，分析了提取香菇多糖的影響因素，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-B

3、enhnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。將提取的香菇粗多糖進(jìn)行分離純化、理化性質(zhì)分析、多糖均一組分結(jié)構(gòu)的初步鑒定，進(jìn)而對(duì)純化后香菇多糖進(jìn)行了抗TMV活性和作用機(jī)制的研究，得出以下研究結(jié)論:
　　1、在單因素考察基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合方法進(jìn)行四因素（提取溫度、提取時(shí)間、料液比、醇沉濃度）三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析。從香菇培養(yǎng)基廢棄物中提取香菇多糖的優(yōu)化工藝參數(shù)為:提取溫

4、度為90℃，提取時(shí)間為4h，液物比為15∶1，醇沉濃度為80％。在此條件下，香菇多糖實(shí)際得率為4.11％，與模型預(yù)測(cè)值4.12％接近。
　　2、香菇培養(yǎng)基廢棄物經(jīng)水提醇沉、Sevag法脫蛋白、活性炭脫色后得粗多糖，經(jīng)DEAE-Sephadex A-52離子交換柱層析得到三種均一多糖組分CLT1、CLT2、CLT3，經(jīng)Sephadex-200凝膠柱層析得高純度多糖LNT。CLT1、CLT2、CLT3中性糖含量分別為78.97％，12

5、.62％，3.12％，LNT的含量為80.25％，不含蛋白質(zhì)和還原性糖，是非淀粉類(lèi)多糖。LNT分子量為26 kDa。紫外光譜分析，多糖LNT在260nm和280nm未見(jiàn)核酸和蛋白吸收;經(jīng)紅外光譜分析可知，多糖LNT具有明顯的多糖特征，且主要含α-糖苷鍵。GC測(cè)定可知，多糖LNT主要由L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-半乳糖組成，并且還有少量的巖藻糖(Fuc);含量分別為2.8％、87.5％、9.6％，其摩爾組成比大約為1∶31∶3。

6、　　3、香菇多糖LNT對(duì)TMV有顯著的抑制作用，其中當(dāng)多糖與病毒混和接種時(shí)，其對(duì)病毒的抑制率在80％以上。此外，香菇多糖對(duì)TMV侵染位點(diǎn)還有較強(qiáng)的保護(hù)作用，且具有明顯的抑制病毒增殖的能力。
　　4、進(jìn)一步從生理和分子生物學(xué)的角度對(duì)多糖LNT抗煙草花葉病毒的機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，香菇多糖對(duì)TMV病毒粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)直接破壞作用，但對(duì)TMV-CP在寄主體內(nèi)的表達(dá)量具有明顯的抑制作用。用500μg/mL LNT處理煙草可以誘導(dǎo)植物早期

7、防御反應(yīng)因子——H2O2、NO的產(chǎn)生和SA的大量積累;同時(shí)，LNT處理還可以引起煙草防御酶系中PAL、POD和PPO酶活性的提高;Real Time PCR檢測(cè)部分抗病基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn):植物體內(nèi)與水楊酸信號(hào)途徑有關(guān)的酸性PR蛋白基因NbPR1a在處理后12內(nèi)表達(dá)量提升了12倍;與H2O2和NO的產(chǎn)生相關(guān)的NbrbohB和NOA1基因均有不同程度的提高。表明，香菇多糖對(duì)煙草花葉病毒的防治是通過(guò)抑制病毒活性和激活植物體內(nèi)以水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑