中國小麥花葉病毒侵染性克隆構(gòu)建及其與宿主HSP70互作研究.pdf

1、上個世紀(jì)末，本實驗室在我國山東冬小麥上鑒定了一種由禾谷多粘菌傳播的新病毒，命名為中國小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)，它能引起小麥花葉病，導(dǎo)致小麥（Triticum aestivum）嚴(yán)重減產(chǎn)。盡管目前在CWMV的生物學(xué)和分子生物學(xué)有了明顯的進(jìn)展，但在其反向遺傳學(xué)及其與宿主相互作用等領(lǐng)域尚存在大量的研究空白。熱休克蛋白70(Heat shock protein70，HSP70)是生物體內(nèi)高度

2、保守的一種分子伴侶蛋白，在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，也是參與多種病毒侵染過程的重要因子。因此，本研究首先圍繞CWMV cDNA克隆構(gòu)建及其侵染活性進(jìn)行了探索，然后基于CWMV侵染性克隆分析了CWMV與宿主HSP70的互作關(guān)系，并取得了以下結(jié)果:
　　首先，構(gòu)建了T7啟動子控制下的CWMV全長cDNA克隆，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、摩擦接種小麥后通過Northern blot、Western blot、電鏡觀察、癥狀等實驗，分析了該克隆的侵染活

3、性。在此基礎(chǔ)上，又構(gòu)建了35S啟動子控制下的CWMV全長cDNA克隆雙元載體，并采用農(nóng)桿菌浸潤法接種本氏煙，實驗分析表明該克隆能夠通過農(nóng)桿菌浸潤法高效地侵染本氏煙，這為開展CWMV的反向遺傳學(xué)奠定了基礎(chǔ)。
　　然后，基于CWMV侵染性克隆分析了CWMV和宿主HSP70之間的關(guān)系。通過qRT-PCR和Western-blot等實驗發(fā)現(xiàn)，在CWMV侵染的宿主小麥和模式植物本氏煙中HSP70較為豐富，表明CWMV侵染影響宿主HSP70的

4、表達(dá)。通過Quercetin藥物處理和VIGS技術(shù)抑制HSP70表達(dá)，能降低CWMV RNA的積累;而過表達(dá)HSP70時，則增加CWMV RNA的積累，該結(jié)果表明HSP70能影響CWMV的復(fù)制。酵母雙雜交試驗(YTH)、BiFC、共定位等實驗表明，CWMV編碼的復(fù)制酶與宿主HSP70蛋白在體內(nèi)外發(fā)生相互作用，而且互作的關(guān)鍵區(qū)域是位于CWMV復(fù)制酶的167-333aa區(qū)域。在植物細(xì)胞內(nèi)，HSP70和CWMV復(fù)制酶能夠互作并形成類似包涵體的