中國(guó)小麥花葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白基因的克隆、表達(dá)及其酵母雙雜交篩選研究.pdf

1、本研究根據(jù)Diao等(1999)發(fā)表的CWMV的RNA1全序列設(shè)計(jì)特異性表達(dá)引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從小麥病葉中擴(kuò)增得到長(zhǎng)約1kb的DNA片段。將其克隆至載體pGEM-T，序列分析表明成功獲得全長(zhǎng)MP基因。開放閱讀框架包括990個(gè)核苷酸，編碼329個(gè)氨基酸，與已報(bào)道的CWMV基因組相應(yīng)核苷酸序列(EMBL登錄號(hào)：AJ012005)同源性為99.6％。將MP基因亞克隆至原核表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pSBET-MP，SDS-PAGE分析表明，

2、轉(zhuǎn)有pSBET-MP的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS高效表37kDa蛋白，與MP基因閱讀框架的理論推算值37.4kDa相符。并以含表達(dá)產(chǎn)物的凝膠為抗原，按常規(guī)方法免疫小鼠，免疫三次后第三天斷頭收集血清。Westernblot分析表明制得的抗血清是針對(duì)MP的多抗，并且具有很強(qiáng)的專一性。ELISA測(cè)定其效價(jià)約為1：1200?！　∮肨rizol提取小麥總RNA后并將其純化成mRNA，應(yīng)用SMART技術(shù)合成第一鏈cDNA。然后用5’和3

3、’PCR引物進(jìn)行LD-PCR擴(kuò)增，合成雙鏈cDNA，并與pGADT7-Rec一起轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，構(gòu)建小麥的酵母雙雜交cDNA文庫?！　P基因重組到質(zhì)粒pGBKT7中，構(gòu)建酵母雙雜交載體pGBKT7-MP，電擊轉(zhuǎn)入酵母菌Y187。Westernblot分析表明MP基因在酵母體內(nèi)能正確表達(dá)具有免疫活性的融合蛋白，并排除對(duì)宿主細(xì)胞的毒害和自激活作用，可作為酵母雙雜交系統(tǒng)中的“誘餌”質(zhì)粒?！　±媒湍妇鶼187(MATα型)和AH