中國(guó)小麥花葉病毒全基因組序列分析及CP、CRP蛋白的蛋核表達(dá)和抗血清制備.pdf

1、中國(guó)小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)屬于帚狀病毒科（Virgaviridae）真菌傳桿狀病毒屬（Furovirus），由禾谷多黏菌（Polymyxa gramins）傳播。其基因組為兩條正單鏈RNA，包裝在不同的粒子內(nèi)。CWMV在我國(guó)山東煙臺(tái)、威海等地發(fā)生普遍，嚴(yán)重威脅小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量。
　　為了明確CWMV的進(jìn)化規(guī)律和致病機(jī)理，本研究測(cè)定了CWMV煙臺(tái)分離物與臨沂分離物的全基因組序列

2、，分析了CWMV的遺傳進(jìn)化特點(diǎn)，并利用原核表達(dá)的衣殼蛋白及富含半胱氨酸蛋白分別制備了特異性抗血清;同時(shí)，獲得了CWMV RNA2的侵染性克隆載體。本文的主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1、擴(kuò)增獲得CWMV煙臺(tái)與臨沂分離物的全基因組序列。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)其RNA1為7147nt，RNA2分別為3563 nt和3564 nt，RNA1與RNA2均含有3個(gè)開(kāi)放閱讀框。在利用RNA1、RNA2全基因及其ORF序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，CWMV均分為兩個(gè)組

3、(Ⅰ和Ⅱ)。煙臺(tái)分離物RNA1、RNA2及其ORF均被聚類到Ⅰ組，臨沂分離物除CP外均聚類到Ⅱ組，CP聚類到了Ⅰ組。我們通過(guò)RDP4軟件進(jìn)行重組分析，發(fā)現(xiàn)CWMV臨沂分離物RNA2的CP區(qū)域發(fā)生了重組。
　　2、利用原核表達(dá)的衣殼蛋白及富含半胱氨酸蛋白制備了特異性抗血清。采用RT-PCR方法克隆CWMV煙臺(tái)分離物的外殼蛋白及富含半胱氨酸蛋白基因，并將其連接到原核表達(dá)載體pEHISTEV，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，

4、產(chǎn)生了分子量均為19 kDa的CP和CRP。將二者從凝膠中切下，經(jīng)乳化后免疫新西蘭大耳兔4次，獲得了CWMV CP及CRP的多克隆抗體。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，CWMV CP和CRP抗血清的效價(jià)分別為1∶4096和為1∶2048。Western Blot分析表明，該抗血清能與CWMV侵染的小麥發(fā)生特異性反應(yīng)，而與健康小麥或小麥黃花葉病毒侵染的小麥均無(wú)反應(yīng)。
　　3、獲得了CWMV RNA2的侵染性克隆載體。利用含T3啟動(dòng)子的引物通