多重PCR檢測三種小麥病毒及小麥黃花葉病素全基因組序列分析.pdf

1、黃淮海地區(qū)是我國重要的小麥種植區(qū)。病毒病尤其土傳花葉病和綠矮病是危害小麥最嚴重的病害之一。在黃淮海地區(qū)引起土傳花葉病的病原為小麥黃花葉病毒(Wheatyellow mosaic virus，WYMV)和中國小麥花葉病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV），這兩種病毒都通過禾谷多黏菌（Polymyxa graminisL.）傳播。引起綠矮病的病原為水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dw

2、arf virus，RBSDV)，主要通過灰飛虱（Laode lphaxstriatellus）傳播。
　　植物病毒的快速檢測對病毒病原鑒定、病害預警及防治起重要作用，同時研究病毒病的流行、病毒的變異及進化趨勢對了解病毒病發(fā)生規(guī)律、病毒致病機理研究及抗病品種培育有重要意義。
　　本研究以多重RT-PCR為基礎，選取危害山東小麥的WYMV、CWMV和RBSDVCP基因設計特異性引物，以Actin為內參基因，建立了一套同步檢測W

3、YMV、CWMV和RBSDV的方法。同時，對檢測體系進行優(yōu)化，PCR反應體系主要參數(shù)最終確定為TaqDNA聚合酶濃度0.025 U/μL，dNTP濃度0.25 mmol/L;擴增條件最終選擇:退火溫度56℃，延伸時間60 s，循環(huán)次數(shù)30次。
　　2013-2014年，對山東省17地市小麥病毒病發(fā)生情況調查后發(fā)現(xiàn)，在濟南、東營、菏澤、萊蕪和德州5地市未發(fā)現(xiàn)疑似樣品，其余12地市共采集到165份樣品。通過多重RT-PCR檢測三種病毒

4、的發(fā)生情況，結果表明:93份樣品中含有WYMV，14份樣品中含有CWMV，11份樣品中含有RBSDV。WYMV主要分布在淄博、棗莊、泰安、煙臺、濟寧、日照、臨沂、聊城及威海。首次在淄博、日照和聊城檢測到WYMV。CWMV在煙臺、威海等老病區(qū)發(fā)生嚴重，并且已經擴展到臨沂地區(qū)。RBSDV在濟寧和臨沂地區(qū)有發(fā)生。煙臺、威海和臨沂存在WYMV和CWMV復合侵染，其中煙臺和臨沂以WYMV為主，威海以CWMV為主。濟寧和臨沂存在WYMV和RBSDV

5、復合侵染，但均以WYMV為主。青島、濱州和濰坊未檢測到這三種病毒。
　　為研究小麥黃花葉病毒的遺傳多樣性，本研究共獲得17個WYMV分離物全基因組序列。序列分析發(fā)現(xiàn):除去ploy(A)，各分離物的RNA1均為7635 nt，開放閱讀框(ORF)為7215 nt，編碼2404個氨基酸;RNA2均為3651 nt，ORF為2712 nt，編碼903個氨基酸。利用重組分析軟件RDP分析發(fā)現(xiàn)分離物LY-1、LY-2、LY-3及LY-4的R

6、NA1序列存在重組，Yamato、Yangzhou及本研究獲得的QF-2、LY-2分離物的RNA2序列存在重組。依據(jù)WYMV RNA1和RNA2編碼序列進行系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)WYMV可分為兩個組，日本Date和Kyowa分離物、中國Ya'an和Zhouzhi分離物及TA-2、LY-6、QF-4、LY-5分離物的RNA1歸屬于Ⅱ組，但日本的Date和Kyowa分離物、中國Zhouzhi分離物及TA-2分離物的RNA2歸屬于Ⅰ組中;與這些分離