小麥黃花葉病毒編碼VPg蛋白結(jié)構(gòu)及其亞細(xì)胞定位分析.pdf

1、小麥黃花葉病是我國冬小麥的重要病毒病，該病由小麥黃花葉病毒（Wheatyellow mosaic virus，WYMV）引起，通過禾谷多黏菌（Polymyxa graminisL）傳播。WYMV屬于馬鈴薯Y病毒科大麥黃花葉病毒屬成員，其基因組是由兩條正義單鏈RNA組成，RNA1編碼8個蛋白，分別是P3、7K、CI、14K、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb、CP; RNA2編碼2個蛋白P1和P2。本研究主要圍繞RNA1編碼的病毒末端

2、結(jié)合蛋白(VPg)展開的。VPg蛋白是一種多功能蛋白，參與病毒的復(fù)制、翻譯、運(yùn)動等基本生命活動。我們采用現(xiàn)代生物信息學(xué)方法分析WYMV VPg蛋白特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)它具有核定位信號與核輸出信號功能。利用細(xì)胞組分分級分離法、免疫電鏡膠體金標(biāo)記法以及熒光定位法觀察到VPg蛋白在真核細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)時定位于細(xì)胞核中，并以兩種形態(tài)存在，一種是在核內(nèi)凝集成一個或幾個形狀不規(guī)則的包涵體;另一種是均勻分布于整個細(xì)胞核中，而在WYMV侵染的小麥葉片細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)在

3、有其他WYMV編碼蛋白存在的情況下，VPg在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有分布。我們根據(jù)NLS和NES設(shè)計(jì)VPg一系列突變體，通過激光顯微鏡觀察它們與GFP融合蛋白在煙草細(xì)胞中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，WYMV VPg中N端第1-22位氨基酸以及NLS序列是其能否定位于細(xì)胞核的關(guān)鍵決定域。
　　為了進(jìn)一步研究VPg蛋白與寄主蛋白或病毒編碼蛋白的互作情況，我們將GST標(biāo)簽載體和GST-VPg融合蛋白進(jìn)行了大量表達(dá)并純化，以它們作為誘餌對感染W(wǎng)YMV的小

4、麥葉片總蛋白進(jìn)行PULL-DOWN實(shí)驗(yàn)，結(jié)果捕獲了6個小麥來源的蛋白和2個WYMV來源的蛋白（CP和NIa）;再利用免疫共沉淀和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示VPg蛋白與CP蛋白發(fā)生結(jié)合，并且結(jié)合部位在VPg蛋白C端第96-187位氨基酸序列，這段序列是它與CP蛋白互作所必須的。當(dāng)CP與VPg互作的同時，CP蛋白協(xié)助VPg從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，它是VPg進(jìn)行核質(zhì)穿梭所需的外在因素，同時NES序列是VPg在細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)、完成核質(zhì)穿