馬鈴薯卷葉病毒CP基因的克隆、原核表達及抗血清的制備.pdf

1、本研究的目的是克隆馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)外殼蛋白(CP)基因并構建其原核表達載體，使其在大腸桿菌中高效表達，用表達的融合蛋白作為抗原制備抗血清，為進一步制備PLRV的ELISA檢測試劑盒打基礎。 從感染PLRV的馬鈴薯病葉中提取總RNA并作模板，通過RT-PCR擴增獲得了PLRV-CP基因的特異性擴增帶?；厥占s630bp的特異擴增片段，然后進行T-A克隆。經PCR檢測及BamHⅠ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ限制性酶切鑒定，篩選

2、出了陽性克隆，其重組質粒被命名為。pGEM-LRCP。序列測定結果表明pGEM-LRCP中的插入片段就是PLRV-CP基因，長627bp，編碼208個氨基酸。該基因與國內外已報道的36個PLRV-CP基因相比，核苷酸序列的同源性高于96％，氨基酸序列的同源性均在97％以上。 以pGEM-LRCP為模板進行PCR，獲得了PLRV-CP基因的擴增產物(無終止密碼)，回收624bp的特異產物并與T表達載體pBAD/Thio-TOPO連

3、接，重組質粒轉化受體菌TOP10獲得了Amp抗性菌落。經PCR檢測及Bsp1407 Ⅰ與Nde Ⅰ的單酶切和雙酶切鑒定，篩選到了陽性克隆，相應的重組質粒被命名為pBAD-LRCP。序列測定表明PLRV-CP基因與載體正向連接、密碼子閱讀正確，但構建的工程菌TOP10(pBAD-LRCP)經阿拉伯糖誘導后沒有預期的表達蛋白。 用pBAD-LRCP作模板，經PCR，刪除了PLRV-CP基因中126bp的富含精氨酸密碼的DNA片段，獲

4、得了帶有突變基因的質粒pBAD-LRCP-126。在37℃，缺失突變體TOP10(pBAD-LRCP-126)用0.2％阿拉伯糖誘導培養(yǎng)4小時后，SDS-PAGE顯示蛋白圖譜上有一條34 kDa的特異性蛋白條帶，其大小與預期的融合蛋白相符。Western blotting分析結果顯示該融合蛋白與國際馬鈴薯中心(CIP)提供的PLRV-IgG有反應，形成明顯的雜交帶，表明該融合蛋白是突變基因正確表達的產物。 用溶菌酶裂解菌體，提取