鵝呼腸孤病毒分離鑒定和σC基因克隆、原核表達(dá)及抗血清的制備.pdf

1、江蘇某鵝養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生一種僅感染雛鵝并以出血性壞死性肝炎為特征的病理變化和顯微病理變化的傳染性疾病。本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)病鵝場(chǎng)采集患病雛鵝的肝臟為病料，接種SPF雞胚分離病毒，通過(guò)臨床癥狀及剖檢病變、序列比對(duì)等方法對(duì)分離的病毒進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明該分離株病毒屬于呼腸孤病毒。通過(guò)絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚、14日齡鵝胚均能引起規(guī)律性死亡和特征性病變，但經(jīng)過(guò)尿囊腔途徑接種病毒的雞胚和鵝胚并不會(huì)死亡。
　　該尿囊液病毒接種原代雞胚成纖維細(xì)胞

2、未觀察到明顯的細(xì)胞病變，細(xì)胞生長(zhǎng)良好。含病毒的尿囊液、絨毛尿囊膜及胚體對(duì)雞胚、鵝胚的半數(shù)致死量(LD50)分別為10-2.76、10-3.18、10-3.9、10-4.3、10-3.7、10-4.2;用收集的尿囊液接種1、30、80日齡鵝，1日齡雛鵝部分發(fā)病死亡，其他鵝均無(wú)明顯的臨床癥狀。另外，血凝試驗(yàn)驗(yàn)證了該病毒無(wú)血凝性。
　　ARV的σC蛋白是S1基因的第三個(gè)開(kāi)放性閱讀框編碼的蛋白，有多種存在形式，是ARV外殼蛋白的重要組成部

3、分，σC蛋白可能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。σC蛋白和細(xì)胞的吸附性相關(guān)，啟動(dòng)了病毒的感染過(guò)程，第三個(gè)ORF基因缺失部分會(huì)導(dǎo)致病毒吸附能力的下降，因此σC蛋白在病毒的感染和致病作用上有比較重要的作用。
　　根據(jù)NCBI上已發(fā)表σC基因的基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性的引物，采用RT-PCR方法擴(kuò)增σC基因片段，將σC基因與T載體相連，把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含IPTG和X-gal的氨芐LB平板上篩選出白色菌落，提取質(zhì)粒DNA，

4、然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步判斷，再送測(cè)序鑒定，克隆的基因片段大小為797bp;克隆到pGEX-6P-1表達(dá)載體上，獲得重組質(zhì)粒pGEX-σC，將重組質(zhì)粒pGEX-σC轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，37℃，0.1mM IPTG誘導(dǎo)5h，通過(guò)SDS-PAGE電泳分析證實(shí)σC基因獲得了表達(dá)，重組蛋白分子量分別約為55KD，命名為GST-σC。以GRV陽(yáng)性血清為一抗，經(jīng)Western-blot分析證實(shí)表達(dá)的融合蛋白抗原性良好。

5、　　用重組菌(pGEX-σC)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白(GST-σC)，經(jīng)過(guò)純化后的蛋白作為免疫原，免疫2.5kg左右的新西蘭白兔2只。三次免疫后用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)，抗體的有效稀釋效價(jià)為1∶6400。制備高效價(jià)的抗體是驗(yàn)證基因表達(dá)和研究基因功能的首要前提，因?yàn)樵摬“l(fā)現(xiàn)相對(duì)其他病毒來(lái)說(shuō)的時(shí)間還很短，目前對(duì)診斷GRV感染的主要方法是病毒的分離鑒定和瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，而融合蛋白的表達(dá)和抗血清的制備可促進(jìn)該蛋白進(jìn)行抗原性分析、制備GST-σC