水貂呼腸孤病毒分離鑒定及反向遺傳初步研究.pdf

1、20世紀50年代呼腸孤病毒的發(fā)現，首次證實了雙鏈RNA病毒可作為穩(wěn)定的生命形式存在于自然界，由于主要從呼吸道或腸道中分離出此病毒，并且當時對它的致病作用不清楚，所以稱它為呼吸道、腸道、孤兒病毒，簡稱呼腸孤病毒（Reovirus）。
　　哺乳動物正呼腸孤病毒（Mammalian Orthoreovirus，MRV）屬于呼腸孤病毒科（Reoviridea）正呼腸孤病毒屬（Orthoreovirus）成員，病毒粒子無囊膜，二十面體對稱，

2、具有雙層衣殼?；蚪M由10條雙鏈RNA組成，分為3個大片段（L1～L3）、3個中片段（M1～M3）以及4個小片段（S1～S4），共編碼8種結構蛋白和3種非結構蛋白。MRV有4個主要的血清型，其代表株為血清1型Lang（T1L）、血清2型Jones（T2J）、血清3型Dearing（T3D）以及血清4型Ndelle（T4N）。
　　目前有關水貂呼腸孤病毒的報道較少，1975年德國研究人員首次從水貂中分離到一株呼腸孤病毒，1992年劉

3、維全等在國內首次報道了一株從水貂中分離的呼腸孤病毒，2011年連海等首次從水貂中分離到一株血清1型呼腸孤病毒HB-A株。雖然大多數呼腸孤病毒感染并沒有明顯癥狀或癥狀較輕，但是該病毒可能與其他病毒混合感染從而加重病情，造成水貂生長遲緩、被毛粗亂，嚴重影響貂皮的質量，從而給養(yǎng)殖業(yè)造成損失。
　　反向遺傳學技術已經廣泛應用于病毒學研究的各個領域，極大推動了病毒學發(fā)展。與經典的從表型改變到進行基因功能研究的思路相反，反向遺傳技術是指通過構

4、建RNA病毒的感染性克隆，在病毒cDNA分子水平上對其進行人工體外操作，如進行基因突變、缺失、插入、置換等改造，從而研究RNA病毒的基因復制與表達調控機制、病毒和宿主細胞的相互作用關系、抗病毒策略和基因治療，以及構建新型病毒載體來表達外源基因和進行新疫苗研制等，因此對RNA病毒進行遺傳拯救已成為分子病毒學研究的必經之路。然而，呼腸孤病毒基因組的復雜性妨礙了其反向遺傳系統的建立，也制約了病毒各方面的研究。
　　2014年山東某貂廠發(fā)

5、生以腹瀉癥狀為主的疾病，取腸道內容物接種于BHK-21和Vero細胞，經盲傳，細胞出現了變圓、脫落等病變。經電鏡觀察，觀察到無囊膜、二十面體對稱、雙層衣殼和直徑約75nm的病毒粒子。RT-PCR和BLAST結果表明，病毒粒子為哺乳動物正呼腸孤病毒，命名為MRV3 SD-14株。測定了SD-14株的病毒滴度、血凝性以及致病性，SD-14株在BHK-21和Vero 細胞上的TCID50為105.625 TCID50/mL和105

6、TCID50/mL；SD-14株在4℃、室溫以及37℃條件下，對人O型血紅細胞以及雞、豚鼠、牛和兔的紅細胞均不發(fā)生凝集反應；將SD-14株經口和腦內接種乳鼠，對乳鼠不致病，對其生長沒有明顯影響。設計特異引物，經RT-PCR獲得了SD-14株全基因組序列，并將序列提交到GenBank數據庫中，登錄號為KT224504-KT224513。序列分析結果表明，SD-14株為血清3型呼腸孤病毒，其L1、L3、M3和S3與人源MRV2Tou05株有

7、較高相似度，分別為97.40％，96.92%，97.09%和97.20%；S2與T1L標準株有較高相似度，為96.17%；L2、M2及S1與豬源的GD-1株有較高相似度，分別為97.39%、98.37%和98.66%；M1和S4與豬源的SC-A株有較高相似度，分別為95.53%和97.58%。此外，SD-14株與貂源的HB-A株具有高度的序列相似性。綜合序列的相似性以及根據每個片段所構建的進化樹，推測SD-14株為人源、豬源以及貂源呼腸

8、孤病毒混合感染產生的新的重組病毒。此外，序列分析顯示，SD-14株的S1片段第246個密碼子為終止密碼子，可能造成σ1蛋白翻譯提前終止，從而對病毒的生物學特性產生影響。SD-14株是首次從水貂中分離獲得的血清3型呼腸孤病毒，SD-14株的分離豐富了水貂呼腸孤病毒的基因庫以及生物特性，對于研究呼腸孤病毒在水貂群中的流行、進化等具有重要意義。
　　為了解呼腸孤病毒在水貂群中的感染情況，本實驗采用微量中和試驗調查了山東、河北以及吉林水貂

9、群中呼腸孤病毒的血清抗體水平，以期從抗體水平了解呼腸孤病毒感染的流行狀況。結果表明，血清陽性率分別為：山東92.5%，河北82.1%，吉林91.7%，表明該病毒在上述地區(qū)水貂群中具有較高水平的感染率。
　　建立呼腸孤病毒反向遺傳操作平臺，是深入研究該病毒的蛋白功能以及致病機制的關鍵途徑。本研究首先對呼腸孤病毒HB-A株進行了全基因組測序，以確定病毒真實的cDNA序列，為下一步構建全長cDNA克隆提供參考。通過RT-PCR獲得呼腸孤

10、病毒HB-A株全基因組10個片段，將其分別插入含T7 RNA聚合酶啟動子、丁肝病毒核酶以及T7 RNA聚合酶終止子的表達盒中，獲得10個重組質粒pcDNA-T7-L1、pcDNA-T7-L2、pcDNA-T7-L3、pcDNA-T7-M1、pcDNA-T7-M2、pcDNA-T7-M3、pcDNA-T7-S1、pcDNA-T7-S2、pcDNA-T7-S3和pcDNA-T7-S4，同時將L1片段2193位的T突變?yōu)镃，作為分子標記，以區(qū)

11、分野毒和重組毒。此外，將σ1s蛋白的起始密碼子由ATG突變?yōu)锳CG，使σ1s蛋白不表達，為構建σ1s蛋白缺失突變型呼腸孤病毒做準備。將10個重組質粒按照合適的配比濃度共轉染BHK-T7細胞系，37℃培養(yǎng)3～5d，收獲細胞并反復凍融3次，在BHK-21細胞上進行傳代。
　　本研究首次分離到一株貂源血清3型呼腸孤病毒MRV3 SD-14株，并對其增殖、感染和血凝等生物學特性進行了鑒定；對山東、河北、吉林等地水貂群的呼腸孤病毒感染率進行