草魚呼腸孤病毒HZ08株的分離鑒定與全基因組分子特征分析.pdf

1、草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)隸屬水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)，是中國大陸分離的第一株魚類病毒，目前己經(jīng)報(bào)道了10多個分離株。該病毒引起我國淡水養(yǎng)殖主要品種草魚(Ctenopharyngodon idellus)在魚種甚至成魚階段發(fā)生出血病，死亡率可高達(dá)60％以上，給我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大損失。自20世紀(jì)50年代以來，我國魚病科研工作者就致力于草魚出血病的防治研究，免疫防治取得了較好

2、的效果。但是，在疫苗應(yīng)用的過程中也發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)的草魚出血病疫苗對本地區(qū)有效，免疫其他地區(qū)則可能效果欠佳甚至完全無效，推測不同地區(qū)的草魚呼腸孤病毒流行株存在較大差異。要想有效的防治草魚出血病，必須開展草魚呼腸孤病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查，弄清不同地區(qū)草魚呼腸孤病毒的流行病學(xué)本底。
　　 本實(shí)驗(yàn)室在開展草魚呼腸孤病毒流行病學(xué)調(diào)查過程中，從浙江湖州地區(qū)的發(fā)病草魚中分離到一株病毒，暫命名為草魚呼腸孤病毒HZ08株(GCRV HZ08)。取

3、感染的草魚腎臟細(xì)胞(CIK)做超薄切片在電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量呈晶格狀排列的病毒粒子，無囊膜，近球形，直徑約70nm，形態(tài)與已報(bào)道的GCRV相似。病毒粒子在CIK細(xì)胞內(nèi)的分布方式與以前報(bào)道相同。將病毒提純后分別經(jīng)DNA酶、RNA酶和綠豆核酸酶消化，證實(shí)為雙鏈RNA（dsRNA）病毒。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果顯示，病毒基因組按分子量大小分為大、中、小三組，共有11個dsRNA組成，呈現(xiàn)典型水生呼腸

4、孤病毒基因組特征。魚體感染實(shí)驗(yàn)表明，HZ08株對草魚魚種(10cm)的致死率在75％左右。
　　 為了從分子水平上檢測病毒，我們根據(jù)GenBank中已發(fā)表的GCRV873株和其他呼腸孤病毒的序列設(shè)計(jì)了18對引物，對HZ08株的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，均沒有得到預(yù)期的目的片段，說明HZ08株與GCRV873株和其他已發(fā)表部分序列的呼腸孤病毒的基因組序列差異較大，而根據(jù)文獻(xiàn)中GCRV861株S6的引物(861-S6)能檢測到HZ08株，說明

5、HZ08株在基因組序列方面與861株可能有一定的相似性，但目前尚未見863株基因組序列的報(bào)道，因此無法從基因序列上進(jìn)行比較。在篩選引物對HZ08株及其他幾株草魚呼腸孤病毒進(jìn)行檢測的過程中，我們發(fā)現(xiàn)采用文獻(xiàn)中根據(jù)水生呼腸孤病毒S6節(jié)段保守區(qū)設(shè)計(jì)的簡并引物可以檢測以873株為代表的一組草魚呼腸孤病毒，采用861-S6引物能夠檢測與873株基因組序列差異較大的一些草魚呼腸孤病毒分離株。在現(xiàn)階段對草魚呼腸孤病毒流行株本底還不清楚的情況下，這兩對

6、引物無疑對毒株的分離鑒定具有重要意義。
　　 為了從分子上進(jìn)一步確認(rèn)病毒種類，弄清楚該分離株的分子遺傳特征,確定HZ08株的分類學(xué)地位及與其他呼腸孤病毒的種系發(fā)生關(guān)系，我們在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，通過對各個技術(shù)環(huán)節(jié)不同處理的對比，對克隆的上游技術(shù)和克隆方法做了重要改進(jìn)，建立了特異性強(qiáng)、省時省力、可重復(fù)性強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)操作方案，成功克隆了HZ08株的11個節(jié)段的全長，獲得了病毒的全基因組序列。病毒的全基因組測序結(jié)果表明，GCRV HZ0

7、8株基因組全長為24.707Kb，其S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11基因組大小分別為3927、3870、3753、2263、2229、2030、1604、1560、1320、1124和1027bp。在GenBank中的登錄號分別為S1GQ896334、S2 GQ896335、S3 GU350742、S4 GU350743、S5 GQ896336、S6GQ896337、S7 GU350744、S8 GU

8、350745、 S9 GU350746、S10 GU350747、S11GU350748。
　　 通過對基因組各節(jié)段的末端序列分析，本研究發(fā)現(xiàn)，除S8的3′末端保守序列為UGCAUC3′外，HZ08株各節(jié)段擁有共同的末端保守序列5.GUAAUUU......UUCAUC3′。另外，鄰近末端保守序列，各個基因節(jié)段又擁有節(jié)段特異的倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列。GCRV HZ08株各節(jié)段的末端保守序列與GCRV873株極為相似，僅在5′末端的保守序列

9、(GCRV8735'GUUAUUU)中相差一個堿基。具有末端保守序列和倒轉(zhuǎn)重復(fù)是呼腸孤病毒科病毒株的一個基本特征，在病毒對其基因組進(jìn)行篩選以及裝配過程中可能起到重要作用。
　　 通過BLAST預(yù)測HZ08株各節(jié)段編碼的蛋白和水生呼腸孤病毒屬，正呼腸孤病毒屬成員編碼蛋白的關(guān)系，使用分子生物學(xué)軟件對各節(jié)段核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，繪制系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹，并分析各基因編碼產(chǎn)物的功能區(qū)與結(jié)構(gòu)域，從而預(yù)測各蛋白的功能。
　　

10、HZ08株各基因組節(jié)段編碼的蛋白功能預(yù)測如下：
　　 (1)S1節(jié)段編碼的蛋白VP1與哺乳動物(MRV)λ2蛋白具有相同的功能motif(鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶功能區(qū)的兩個必須賴氨酸在173和195位，附近具有S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的結(jié)合位點(diǎn)(LDLGTGPEA/C)，位于第832-838位氨基酸）。預(yù)測HZ08株VP1蛋白具有鳥苷轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶活性，是病毒的RNA帽化酶，在病毒復(fù)制時mRNA的加帽過程中發(fā)揮作用。
　

11、　 (2)S2節(jié)段編碼的蛋白VP2具有RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)的功能，具有RdRp特有的三個功能motif(motifⅠ位于592-602氨基酸，motifⅡ(SG)位于688-689氨基酸，motifⅢ(GDD)位于739-741氨基酸）。RdRp在呼腸孤病毒科各屬之間是最保守的，氨基酸序列分析也表明，motifⅡ(SG)和motifⅢ(GDD)在呼腸孤病毒中是完全保守的。
　　 (3)S3節(jié)段編碼的VP3蛋白具

12、有鋅指結(jié)構(gòu)和N端特征性親水區(qū)，推測與MRVλ1蛋白具有相似的功能，即具有ATPase活性，還能與病毒dsRNA連接。
　　 (4)S4節(jié)段編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，與MRVμN(yùn)S的同源性約在25％。
　　 (5)S5節(jié)段編碼的蛋白VP4與MRVμ2蛋白的同源性高達(dá)25％，發(fā)現(xiàn)具有ATPase的兩個特征性基序：motifA（TIAMAKGSFKST,400-411），motifB(DDAG,435-438)。據(jù)此可以推測HZ0

13、8株VP4蛋白可能具有核苷三磷酸酶活性。
　　 (6)S6節(jié)段編碼的蛋白VP5與MRV的μ1蛋白同源性高達(dá)24％，在HZ08株VP5蛋白中發(fā)現(xiàn)了天冬氨酸和脯氨酸裂解位點(diǎn)，這個裂解位點(diǎn)在所有的正呼腸孤病毒和水生呼腸孤病毒中都存在。并且發(fā)現(xiàn)HZ08和MRV的親水曲線十分相似，C末端有4個較大的親水區(qū)，且都位于蛋白的表面，推測能形成環(huán)和折疊結(jié)構(gòu)，與VP5蛋白和其他病毒蛋白的相互作用有關(guān)。同時還發(fā)現(xiàn)這4個區(qū)域的抗原性都較高，推測可能引起

14、宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)。此外，VP5蛋白N端的疏水區(qū)較多，推測這些疏水區(qū)可能與病毒的侵入有關(guān)。
　　 (7)S7節(jié)段編碼一個長達(dá)512個氨基酸的蛋白質(zhì)(VP56)，其N端約300多個氨基酸與MRVσ1的同源性為22％。通過motifscan對S7編碼的蛋白進(jìn)行基序分析，發(fā)現(xiàn)兩個N端糖基化位點(diǎn)(525-528)，由此推測VP56可能是一種糖基化蛋白，其中一個或多個糖基化位點(diǎn)可能與病毒和細(xì)胞的吸附有關(guān)。
　　 (8)S9能夠編碼

15、一個長達(dá)418個氨基酸的蛋白質(zhì)(VP47)，與MRVσ2蛋白具有較高的同源性，親水曲線和二級結(jié)構(gòu)也與MRVσ2較為相似，推測VP47與σ2有相似的功能。
　　 (9)S10編碼的蛋白VP38由345個氨基酸組成，與ARV的σNS具有較高的同源性，是一個糖基化蛋白，推測有與ssRNA連接的活性。
　　 (10)S8和S11都包含一個單一的ORF，未搜索到同源性蛋白，預(yù)測編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。
　　 本研究為我國草魚