牛腺病毒2型中國分離株的鑒定及全基因組序列分析.pdf

1、牛腺病毒3型(Bovine adenovirus3,BAV3),為腺病毒科(Adenoviridae)哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)的成員,屬于牛腺病毒(Bovine adenovirus,BAV)第一群,能在已建立的牛細(xì)胞系中良好生長,且與其他哺乳動物腺病毒存在共同的補(bǔ)體結(jié)合抗原。BAV3是引起牛呼吸道疾病的主要病原體之一,特別是新生犢牛。臨床上主要以肺炎等呼吸道癥狀為主,常伴發(fā)混合感染和繼發(fā)感染,并能夠引起新生倉鼠

2、腫瘤。近年來,我國犢牛呼吸道肺炎頻繁發(fā)生,給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。自1965年Darbyshire等首次從健康牛結(jié)膜中分離獲得BAV3以來,BAV3感染已在世界范圍內(nèi)廣泛流行,目前我國還沒有有關(guān)牛腺病毒3型的報道,更沒有相關(guān)的診斷試劑和疫苗。
　　 本研究于2009年由患急性呼吸道病牛鼻拭子中分離獲得一株病毒,該牛表現(xiàn)精神沉郁,呼吸困難,體溫40℃以上,流鼻液等。將采集的牛鼻拭子處理后取上清液接種于MDBK細(xì)胞盲傳至第二代出現(xiàn)

3、了特征性的山脊?fàn)罴?xì)胞病變；電鏡下觀察可見立體對稱結(jié)構(gòu),大小約70nm的病毒粒子,與腺病毒相符；直接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明分離株與熒光標(biāo)記的山羊抗BAV3多克隆抗體反應(yīng)呈陽性。微量HA試驗(yàn)結(jié)果表明,該分離株能凝集牛紅細(xì)胞,HA效價為1:64,而對小鼠、大鼠、豚鼠、雞、馬和綿羊的紅細(xì)胞無凝集作用；病毒熱敏感試驗(yàn)表明.50℃15min能夠使分離株的TCID50值下降2.2個滴度,56℃30min則完全滅活,該分離株屬于BAV第一群；根據(jù)已發(fā)表的

4、BAV3全基因組序列,在E2A基因區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物,以抽提的BAV3分離株DNA為模板進(jìn)行PCR,擴(kuò)增出長約644bp的目的片段。PCR產(chǎn)物克隆測序后,基于E2A基因的進(jìn)化樹分析表明分離株與BAV3屬于同一分支,且對E2A基因編碼產(chǎn)物DBP蛋白同源性比較分析顯示,分離株與已報道的BAV3同源性最高,在98％以上,而與其它腺病毒的同源性較低。綜合以上試驗(yàn)表明該分離株為BAV3,命名為BAV3 HLJ0955株。這是國內(nèi)首次分離獲得BAV3

5、的報道。
　　 本研究參考GenBank上BAV3標(biāo)準(zhǔn)毒株WBR-1的全基因組序列設(shè)計(jì)了42對引物,對分離到的中國株HLJ0955進(jìn)行全基因組測序,結(jié)果表明HLJ0955株基因組全長為34132bp,A+T含量為46.41％,G+C含量為53.59％。與WBR-1株全基因組進(jìn)行比較分析,結(jié)果顯示HLJ0955株在ITR區(qū)、E1B區(qū)和FA ORF1區(qū)有大段堿基缺失,但二者各段基因的核苷酸相似性較高,為92.7％-100％；各段基因