豬嵴病毒W(wǎng)UH1株全基因組序列分析及病毒的分離.pdf

1、嵴病毒(Kobuvirus)屬于微小RNA病毒科（Picornaviridae），是一種無囊膜的單股正鏈RNA病毒，可感染人和動物。嵴病毒屬現(xiàn)包含愛知病毒(Aichivirus，AiV)和牛嵴病毒(Bovine kobuvirus，BKV)。2007年，匈牙利學(xué)者在檢測豬杯狀病毒時發(fā)現(xiàn)了嵴病毒屬的一個候選成員—豬嵴病毒(Porcine kobuvirus，PKV)。此后，PKV在歐洲、亞洲和美洲的豬中檢出率都非常高，但其與疾病之間的聯(lián)系

2、尚不清楚。已有報道愛知病毒會引起人腸胃炎，BKV可能導(dǎo)致牛的腹瀉，并且研究發(fā)現(xiàn)PKV在具有腹瀉癥狀的豬群中陽性率明顯高于無腹瀉癥狀的豬群，這些提示我們PKV也許是引起豬腹瀉的一個新病原體。
　　 現(xiàn)在已有大量有關(guān)PKV部分核酸序列的報道，但關(guān)于全基因組的報道較少，而全基因組的序列分析有助于人們更好地了解不同毒株之間的進化關(guān)系。愛知病毒和BKV分別于1991年和2003年被分離到，但目前還沒有分離出PKV病毒粒子，這使得許多關(guān)于P

3、KV的研究不能進行。鑒于以上基礎(chǔ)，本研究從豬嵴病毒RT-PCR診斷方法的建立、基因組遺傳進化分析和病毒粒子的分離等方面開展了實驗，具體研究內(nèi)容包括:
　　 1.豬嵴病毒RT-PCR檢測方法的建立和應(yīng)用
　　 參考國際上首次報道的豬kobuvirus/swine/S-1-HUN/2007/Hungary株(GeneBank accession number EU787450)的基因組序列和檢測方法，針對其3D基因設(shè)計了一對

4、保守序列的PCR引物，引物能特異性擴增495 bp的DNA片段。實驗證明該方法特異性良好，敏感性高，重復(fù)性良好。用建立的RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)華中地區(qū)已有較高陽性率的PKV病毒感染，應(yīng)該引起重視。
　　 2.PKV基因組序列的測定和分析
　　 設(shè)計涵蓋PKV基因組的9對引物，對來自湖北武漢的一份陽性樣品進行了全基因組分段擴增，5'端采用RACE方法擴增，利用DNAStar軟件將序列進行拼接，獲得WUH1株全基因組序列。

5、結(jié)果表明，WHU1株基因組全長8210bp，包含一個開放閱讀框(ORF)，編碼2488個氨基酸，相對于S-1-HUN/2007/Hungary參考株，WUH1株5'UTR插入一個堿基，3'UTR缺失一個堿基而序列總長不變?；谌L基因的進化樹分析，我國的PKV流行毒株處在一個進化分支上，而與匈牙利分離株關(guān)系相對較遠。
　　 3.PKV的分離
　　 將PCR檢測結(jié)果為陽性的樣品處理后接種長滿單層的Vero細胞并盲傳6代，裂