豬戊型肝炎病毒全基因組序列分析及感染性克隆的構(gòu)建.pdf

1、本研究在已知豬HEV swDQ株全基因組序列的基礎(chǔ)上，根據(jù)基因組和克隆載體的酶切位點(diǎn)，將豬HEV全基因組分為6個(gè)片段進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增，將得到的片段經(jīng)過(guò)一系列的克隆和亞克隆后，分別構(gòu)建了含有基因組全-長(zhǎng)cDNA克隆的pHE和pCHE重組質(zhì)粒。在pHE中，cDNA克隆的5‘端上游引入了T7啟動(dòng)子序列，并選取一個(gè)克隆在3’端引入了分子標(biāo)志NruI位點(diǎn)。進(jìn)行全序列測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)了7個(gè)核苷酸的缺失和一個(gè)核苷酸的插入，運(yùn)用PCR突變修補(bǔ)了突變的

2、堿基，最終獲得了含有分子標(biāo)志NruI的HEV swDQ株基因組全長(zhǎng)cDNA的重組質(zhì)粒pHEa。體外轉(zhuǎn)錄后，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)和RT-PCR初步檢測(cè)為陽(yáng)性。在pCHE中cDNA克隆的5’端上游引入了T7啟動(dòng)子序列、錘頭狀核酶;3’端引入了丁型肝炎病毒核酶，利用載體上的CMV、β-actin啟動(dòng)子，將含有HEV swDQ株基因組全長(zhǎng)cDNA的pCHE轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞和HepG2細(xì)胞后，通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)