口蹄疫病毒OH-99株細(xì)胞傳代毒全基因組序列測(cè)定及其感染性克隆的構(gòu)建.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)引起的偶蹄動(dòng)物感染的一種烈性傳染病,該病的發(fā)生和流行嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展,因此,世界各國(guó)非常重視對(duì)該病的研究.本研究根據(jù)FMDV的基因組核苷酸序列設(shè)計(jì)并合成了數(shù)對(duì)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的寡核苷酸引物.利用3'-RACE方法從OH/99株細(xì)胞傳代毒中擴(kuò)增得到一7300bp

2、片段,同時(shí),采用常規(guī)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到其5'-非翻譯區(qū)(5'-untranslated region,5'-UTR)的S片段和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(internal ribosome entry site,IRES),分別克隆至pGEM-T Easy載體中進(jìn)行序列測(cè)定.應(yīng)用連接PCR的方法將15bp poly(C)序列插入S和IRES兩片段之間,并將連接片段插入pBluescript SK,然后將7300bp片段從pGEM-T

3、Easy載體上切下,插入重組體pBluescript SK中,構(gòu)建了OH/99株全長(zhǎng)cDNA.以全長(zhǎng)cDNA重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)Nde Ⅰ消化后,利用噬菌體T7啟動(dòng)子聚合酶系統(tǒng)啟始合成RNA轉(zhuǎn)錄本,借助脂質(zhì)體將RNA轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞.轉(zhuǎn)染細(xì)胞連續(xù)傳3代后出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變,通過(guò)RT-PCR和電子顯微鏡觀察均確證了感染性病毒粒子的產(chǎn)生.將此基因工程毒接種乳鼠后出現(xiàn)了典型的臨床癥狀,進(jìn)一步說(shuō)明了FMDV