新城疫病毒CH2000株全基因組的序列測定及其對鵝的致病力試驗.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease Virus，NDV)引起的一種禽類急性、高度接觸性、致死性傳染病。該病發(fā)病急、致死率高，對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅，因此被世界動物衛(wèi)生組織定為須通報的疫病(2005年之前為A類疫病)，我國農(nóng)業(yè)部將其列為一類疫病。新城疫病毒在分類地位上屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒屬(AvbulaVirus)的成員之一，為

2、單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒。整個基因組長度約為15kb，包含6個功能基因：3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，分別編碼6個主要蛋白質(zhì)(NP蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、HN蛋白和L蛋白)。 本研究選取4株本實驗室分離保存的新城疫病毒，編號分別為CH2000、06-74、06-87和07-12，對其生物學(xué)特性和遺傳特性進行了初步研究。采用OIE推薦的辦法對其雞胚平均致死時間測定(MDT)和一日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)進

3、行了測定，結(jié)果四株分離株的ICPl分別為1.83、1.92、1.86、1.86，MElT為60h、67.2h、62.4h、52.8h，表明四株分離株均屬于強毒株。采用RT-PCR對4株分離株F基因的主要功能區(qū)片段進行了擴增、克隆和序列分析。結(jié)果表明4株分離株F蛋白裂解位點的組成為112R-Q-K-R-F117,具有新城疫典型強毒株的分子特征，與其致病指數(shù)測定結(jié)果一致。遺傳進化分析表明4株分離株在分類地位上均屬于基因Ⅶ亞型，與近年來我國主

4、要流行的基因型一致。 參考GenBank中發(fā)表的相關(guān)全基因組參考序列，設(shè)計了9對特異性引物，采用RT-PCR方法對分離株CH2000全基因組進行擴增、克隆和序列測定，使用DNASTARSeqMan進行全基因組序列拼接，通過繪制各基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹來分析該毒株遺傳變異情況，結(jié)果表明該分離株全基因組長度為15192nt，基因組長度符合“六堿基法則”。其全基因組核苷酸的同源性及分子進化關(guān)系與Goose paramyXOVirusSF

5、02、ZJl兩株毒株親緣關(guān)系相對更近，由此推測此分離株可能與Goose paramyXOVirUS SF02、ZJl兩株病毒有著共同的祖先。 選取CH2000和經(jīng)典參考株F48E8，對15日齡的非免疫五龍鵝進行了人工感染試驗。結(jié)果表明在攻毒劑量為105ELD50/1ml條件下，CH2000肌注組的發(fā)病率和死亡率均為100％，口服、滴鼻組的發(fā)病率和死亡率均為93％；參考株F48E8肌注組的發(fā)病率和死亡率均為100％、60％，口服、

6、滴鼻組的發(fā)病率和死亡率分別為100％、53％。人工感染鵝的潛伏期為50-80小時，大部分在4-5天死亡。發(fā)病鵝表現(xiàn)明顯的臨床癥狀和病理變化。 本研究通過對4株近年來新城疫病毒分離株進行系統(tǒng)的生物學(xué)特性研究，證實4株病毒均屬于強毒株，在分類地位上屬于基因Ⅶ型，與我國目前流行的主要基因型一致。通過對2000年分離到的CH2000進行全基因組序列測定，為進行新城疫病毒的遺傳與衍化的研究提供了實驗數(shù)據(jù)并進一步為NDV的反向遺傳學(xué)技術(shù)奠定