鵝源新城疫病毒感染對鵝免疫功能作用的分子機制.pdf

1、我國水禽養(yǎng)殖位居世界首位，每年有大量禽（如鵝）死于傳染性疾病，尤其是具有高傳染性、高致病性的新城疫病毒(New castle disease virus，NDV)。接種傳統(tǒng)雞用NDV疫苗不能有效預防鵝感染NDV。因此，應該尋找其它方法來抑制病毒感染。其中一種可行的方法是通過飼養(yǎng)來刺激提高鵝的免疫系統(tǒng)。近些年來，防御素(Avian beta-defensins，AvBDs)被認為是脊椎動物的重要天然免疫調(diào)節(jié)劑。
　　本實驗設計特異性

2、引物，利用RT-PCR方法從鵝體內(nèi)擴增出四個新的鵝β-防御素:AvBD4、AvBD7、AvBD12、AvBD16，iNOS，7個Toll樣受體(TLR):TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15和8個細胞因子:白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-18(IL-18)、γ干擾素（IFN-γ）、主要組織相容性復合體(MHC

3、 classⅠ)、FAS配體(FASLG)。其中鵝AvBD4包含171個堿基，編碼56個氨基酸;鵝AvBD7、AvBD12、AvBD16分別由201個、198個、180個堿基組成，分別編碼66個、65個、59個氨基酸。經(jīng)同源性分析，鵝AvBD4與雞AvBD4同源性最高為80.9％;鵝AvBD7與鴨、雞AvBD7同源性最高為84.4％;鵝AvBD12與雞AvBD12同源性為87.4％;鵝AvBD16與鴨AvBD16同源性最高為66.3％。

4、此外分析鵝TLRs、iNOS及細胞因子序列，結(jié)果顯示鵝TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15與鵝TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15同源性分別為:99％、100％、100％、100％、100％、100％;鵝IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ、MHC classⅠ、FASLG與鵝IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ、MHC classⅠ

5、同源性為100％、100％、100％、100％、100％、100％、93％。而鵝TLR1、iNOS、FASLG與雞TLR1、iNOS、FASLG同源性為98％、90％、89％，所以將其命名為鵝TLR1、iNOS、FASLG。
　　為研究新鵝β-防御素的生物學活性，采用His標簽蛋白原核表達系統(tǒng)，將四個基因分別亞克隆到pProEXHTa上，構(gòu)建4個重組表達質(zhì)粒。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosseta感受態(tài)中，用IPTG進行誘導，

6、誘導后經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳分析，誘導表達的蛋白大部分都以包涵體形式存在。重組蛋白抗菌活性測定結(jié)果表明，四種重組蛋白對這五種菌均具有抗菌活性，且隨蛋白濃度的增加抑菌活性增強。此外，高濃度鹽離子抑制重組蛋白的抗菌活性。重組蛋白對雞紅細胞沒有溶血活性。
　　為探討鵝β-防御素體內(nèi)抗NDV感染的作用機制，本實驗將20只40日齡的健康鵝，隨機分為兩組，其中對照組10只，攻毒組10只。攻毒組通過點眼、滴鼻的方式以每只鵝100

7、ul稀釋后的Go/CH/LHLJ/1/06NDV接種。對照組10只，不攻毒。攻毒組與對照組分別在攻毒后的36h、72h各取5只鵝頸部放血致死，采取呼吸、消化、免疫系統(tǒng)的氣管、肝臟、腺胃、肺臟、盲腸扁桃體、腎臟、脾臟、法氏囊、哈德氏腺、腦10個組織，采用實時熒光定量RT-PCR法，從感染Go/CH/LHLJ/1/06病毒后36h和72h后的鵝10個組織中檢測Go/CH/LHLJ/1/06病毒含量、鵝β-防御素、iNOS、TLRs和細胞因子

8、基因的含量，并且分析組織中病毒載量與鵝β-防御素的相關性。結(jié)果表明，對照組未檢測到Go/CH/LHLJ/1/06病毒，而攻毒后可在肺臟、腎臟、肝臟、腺胃、脾臟、盲腸扁桃體、法氏囊中檢測到Go/CH/LHLJ/1/06病毒，且攻毒后36h和72h在脾臟和肝臟中差異顯著。對脾臟組織中病毒含量和鵝β-防御素相關性分析，結(jié)果顯示，攻毒后36h只有AvBD1、AvBD5、AvBD10、AvBD12、AvBD16與病毒載量呈現(xiàn)相關性，且只是AvBD

9、12差異顯著(P＜0.05);攻毒后72h AvBDs均呈現(xiàn)相關性，且AvBD4、AvBD5、AvBD6、AvBD9、AvBD10、AvBD12相關性差異顯著（P＜0.05或P＜0.01）。對目的基因檢測結(jié)果顯示，除了鵝AvBD3基因未檢測出來和TLR4分布局限以外，其余基因在組織中分布廣泛，其中鵝AvBD2、AvBD5、AvBD7、AvBD9和AvBD12在對照組和攻毒組36h和72h的檢測的是10個組織中均檢出，且表達差異不顯著(P

10、＞0.05);鵝AvBD1、AvBD6、AvBD10基因不是在所有組織中都能檢測到，并且表達差異不顯著(P＞0.05);而鵝攻毒后72h鵝AvBD4基因在的腦、氣管和脾臟中表達量顯著下調(diào)(P＜0.05)，鵝攻毒后36h鵝AvBD16基因在的盲腸扁桃體和哈德氏腺組織中表達顯著上調(diào)(P＜0.05)，在攻毒后72h的腦組織中顯著下調(diào)(P＜0.05)。其中，鵝攻毒36h后鵝TLR1基因在肺臟、盲腸扁桃體及哈德氏表達量上調(diào)，在肝臟表達量下調(diào)，且差

11、異顯著(P＜0.05)，在攻毒后72h鵝TLR1在肝臟、盲腸扁桃體及法氏囊表達量上調(diào)且差異顯著(P＜0.05);鵝攻毒后72h鵝TLR2基因在盲腸扁桃體表達量顯著上調(diào)(P＜0.05);鵝攻毒后72h鵝TLR7基因在脾臟中顯著上調(diào)(P＜0.05)。鵝攻毒后與對照組相比鵝TLR3、TLR4、TLR5和TLR15基因表達量變化不顯著(P＞0.05)。此外，鵝攻毒后72h鵝iNOS在脾臟中表達量顯著上調(diào)(P＜0.05)，鵝攻毒后72h鵝IFN-

12、γ在法氏囊表達量顯著上調(diào)(P＜0.05)，鵝攻毒后72h鵝IL-8在盲腸扁桃體顯著上調(diào)(P＜0.05)，鵝攻毒后36h鵝MHC classⅠ在哈德氏腺顯著上調(diào)(P＜0.05)。
　　根據(jù)以上結(jié)果，選擇AvBD4和AvBD16用于體外抗NDV研究。結(jié)果表明，重組鵝AvBD4和AvBD16蛋白體外抑制NDV（Go/CH/LHLJ/1/06株）病毒復制作用不顯著。
　　綜上所述，本實驗從鵝體內(nèi)分離出四個新的鵝β-防御素，其重組蛋白