新城疫病毒激活NLRP3炎癥小體及其作用.pdf

1、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV)屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），基因組為單股負鏈不分節(jié)的RNA。NDV能引起對禽類高度致死的疾病新城疫，但對人類而言，NDV并不致病，而是一種重要的溶瘤病毒，研究NDV抗腫瘤的機制有利于NDV在抗腫瘤治療中的應用。通常認為NDV抗腫瘤的效果源于病毒感染導致的細胞死亡和刺激天然免疫和適應性免疫反應。病毒感染會引起細胞

2、死亡，但其機制并不相同，目前研究發(fā)現NDV能誘導細胞凋亡和自噬，凋亡是一種由半胱天冬酶（Caspase）調節(jié)的，細胞核和細胞質固縮，細胞膜逐漸形成凋亡小體的細胞死亡方式，不引起炎癥，自噬同樣不引起炎癥，細胞發(fā)生自噬會降解細胞組分，在細胞內形成自噬泡，研究發(fā)現NDV導致的細胞凋亡在抗腫瘤效應中發(fā)揮了重要的作用，而引起的細胞自噬能通過抑制凋亡促進病毒復制，使病毒能大量復制，進而有利于其抗腫瘤，因此我們推測NDV是否引起其他死亡方式發(fā)揮抗腫瘤

3、的作用，此外，NDV如何調節(jié)宿主天然免疫系統(tǒng)從而成功殺死腫瘤細胞的機制有待研究。
　　天然免疫反應是抵御病原微生物的第一道防線，其中炎癥小體是一種大分子的復合信號平臺，它能活化前炎性因子pro-IL-1β和pro-IL-18，誘導一種細胞炎性死亡—焦亡（pyroptosis）；炎性因子IL-1β和IL-18的分泌需要兩個信號，第一信號是pro-IL-1β和pro-IL-18的表達，這由轉錄激活因子NF-κB信號通路調控，上游主要是

4、模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，例如Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)等，第二信號來源于炎癥小體的激活，它能導致Caspase-1自催化激活，活化的Caspase-1剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，形成有功能的活性形式；焦亡不同于其他細胞死亡方式，由 Caspase-1調節(jié)，焦亡導致細胞膜破裂并釋放大量炎癥因子和病原微生物，引起病理性炎癥。

5、NDV在發(fā)揮抗腫瘤作用中是否會通過炎性小體的途徑刺激機體的天然免疫系統(tǒng)，導致腫瘤細胞發(fā)生焦亡尚不清楚，圍繞“炎癥小體—炎癥反應”信號通路為主要方向，利用NDV病毒與THP-1誘導的巨噬細胞模型進行了一系列的研究，研究結果表明：
　?。?）NDV感染PMA誘導的THP-1細胞導致IL-1β分泌上調，THP-1細胞經PMA誘導分化形成巨噬細胞，NDV強毒株Herts/33感染12h后，IL-1β分泌顯著上調，IL-1β分泌量與病毒感染

6、時間和計量正相關，但UV滅活的病毒不能誘導巨噬細胞分泌IL-1β，通常IL-1β由Caspase-1剪切，Caspase-1的活性由炎癥小體調控，采用Caspase-1的抑制劑處理后發(fā)現NDV誘導的IL-1β顯著下調，表明NDV能誘導IL-1β分泌，且該活性由Caspase-1調控，以上結果表明NDV感染巨噬細胞能夠激活炎性小體，誘導IL-1β分泌。
　?。?）NDV激活NLRP3炎癥小體，我們通過構建穩(wěn)定表達shRNA的THP-

7、1細胞系，干擾NLRP3的表達，Western blot結果顯示NLRP3干擾細胞系中NLRP3的表達水平下降，已知ATP是NLRP3的陽性刺激物，因此采用LPS+ATP刺激干擾NLRP3的THP-1細胞，結果發(fā)現在干擾細胞系中，ATP誘導的IL-1β分泌顯著下降，這表明NLRP3干擾成功。NDV感染該細胞系后，IL-1β分泌量同樣下降了，同時還構建了NLRP3炎癥小體的其他組分的干擾細胞系，ASC和pro-Caspase-1干擾細胞系

8、，結果同樣顯示NDV誘導的IL-1β水平下調；還通過NLRP3敲除小鼠的骨髓源巨噬細胞（bone marrow-derivedmacrophages，BMDM）驗證，以上結果證明NDV可以激活NLRP3炎癥小體。
　?。?）NDV感染激活炎癥小體，導致細胞發(fā)生焦亡；炎癥小體活化能誘導一種細胞死亡方式—焦亡，分析NDV對NLRP3干擾細胞系的細胞毒性，細胞接種1MOI的Herts/33后，18h檢查細胞死亡情況，相比對照組，干擾細胞

9、系均存活率更高，為了進一步驗證該結果，采用了Caspase-1、Caspase-3和Caspase抑制劑處理細胞，其中Caspase-1調節(jié)焦亡，Caspase-3調節(jié)凋亡，Caspase能抑制所有該家族的酶類，結果發(fā)現抑制劑能下調細胞死亡率，進一步研究結果發(fā)現NDV感染THP-1和HeLa細胞均能誘導GSDMD的剪切，剪切下來的GSDMD的氨基端能直接誘導細胞焦亡，以上結果顯示NDV感染可以誘導NLRP3炎癥小體活化，并進一步引起細胞

10、焦亡。
　?。?）炎癥小體活化能抑制NDV復制，0.01 MOI Herts/33接種THP-1細胞后，不同時間點檢查病毒滴度，結果發(fā)現在60h時，在NLRP3，ASC和Caspase-1的干擾細胞系中，病毒滴度較高，病毒復制可能得益于細胞未發(fā)生焦亡，延長了病毒復制時間，為了進一步驗證此結果，我們同樣測定了Caspase-1、Caspase-3和Caspase抑制劑處理細胞中的病毒滴度，結果一致，這表明NLRP3炎癥小體在抵抗ND

11、V感染中發(fā)揮重要作用。
　?。?）NDV的P和V蛋白能抑制NLRP3炎癥小體活化誘導的IL-1β分泌；我們構建了穩(wěn)定表達病毒蛋白P、V、W和NP的THP-1細胞系，相比對照組，表達P和V蛋白的細胞在LPS+ATP的刺激下，細胞上清中檢查到更少量的IL-1β，為了驗證這一結果，選擇天然缺失NLRP3和ASC的293T細胞，轉染炎癥小體組分，重建NLRP3炎癥小體，結果發(fā)現P和V蛋白同樣能抑制IL-1β的分泌，在293T中轉染NLRP

12、3和ASC與病毒蛋白，間接免疫熒光結果發(fā)現P和V蛋白與NLRP3共定位，以上結果證明NDV的P與V蛋白抑制NLRP3炎癥小體活化。
　　本文使用THP-1細胞，證明了NDV能誘導NLRP3炎癥小體的活化，并引起細胞炎性死亡焦亡，在細胞水平上驗證了NLRP3炎癥小體與病毒復制的關系，NLRP3炎癥小體是細胞對NDV感染的天然免疫反應，能抑制病毒復制，而病毒蛋白P和V能抑制NLRP3炎癥小體的活性，本研究為進一步揭示NDV抗腫瘤機制和