動物MHC分子抗新城疫病毒作用的研究.pdf

1、主要組織相容性復合體(Majorhistocompatibilitycomplex,MHC)由一組緊密連鎖的、高度多態(tài)的基因座組成。它在脊椎動物的移植排斥反應、免疫應答以及免疫調(diào)控等方面起重要的作用,是當今免疫學研究的熱點內(nèi)容。多態(tài)性是MHC基因最顯著的特性,與疾病的易感性密切相關。MHCI類分子主要負責呈遞內(nèi)源性抗原肽,最近研究發(fā)現(xiàn)它還可以交叉呈遞外源性抗原。現(xiàn)在已清楚交叉呈遞是機體免疫系統(tǒng)檢測組織及吞噬細胞中的異源蛋白的主要機制。所

2、以,研究MHC多態(tài)性特性和抗原交叉呈遞機制是疾病評估與防治、分子育種以及新型抗病毒疫苗研發(fā)的基礎。本文主要研究了雞MHCI類分子結構與抗新城疫病毒(Newcastlediseasevirus,NDV)之間的關系以及恒定鏈(Invariantchain,Ii)作為免疫載體增強抗原肽交叉呈遞效率的作用。
　　首先,我們通過血凝抑制試驗(hemagglutinationinhibitionassay,HI)測定雞血清中特異性抗NDV抗體

3、的水平,篩選得到高抗體組(G組)20個個體,低抗體組(D組)10個個體。然后采用RT-PCR(Reversetranscription-PCR)方法從兩組中獲得191條雞MHCIα基因,它又稱為雞BF基因。其中,155條是BF2,占81.2％,36條是BF1,占18.8%。BF2是雞主要表達的MHCIα基因,負責識別和呈遞病毒抗原。BF1是次要表達的基因,有的個體甚至檢測不到BF1基因的表達產(chǎn)物。序列比對顯示BF2基因的多態(tài)性要高于BF

4、1基因,而且,BF2分子含有不同于BF1的保守基序。BF2基因的多態(tài)性主要體現(xiàn)在α1/α2區(qū)域,它對應于I類分子抗原結合槽部位。系統(tǒng)進化樹分析表明BF2和BF1基因明顯屬于兩大分支,說明二者具有不同的進化歷史。與預測的人和小鼠的3-D結構顯示,雞BF2分子與哺乳動物的MHCI類α分子的肽結合區(qū)結構相似。通過克隆、分析高度多態(tài)區(qū)域(sp/α1/α2,sp指信號肽),我們發(fā)現(xiàn)一個個體最多可表達6-8種不同的MHCI類α分子,其中有1種數(shù)量很

5、多,是主要的I類分子亞型。因此,我們選擇這一類序列作BF2分子。我們從G、D組中共篩選出30個BF2分子,然后進行序列比對和結構分析,篩選可能與識別病毒抗原肽相關的I類分子基序。G組和D組之間存在差異顯著的兩段區(qū)域,分別位于第123-128位氨基酸和第147-153位氨基酸。G組第1個區(qū)域序列的7氨基酸基序(FDKGTMT)完全保守,構成β轉角且位于肽結合溝槽(peptide-bindinggroove,PBG)的外圍,它可能不參與抗原

6、肽的結合。第2個區(qū)域也屬于7氨基酸基序,它們分成兩類:GDYAEGL和ESEPERW,它們參與α2結構域中α螺旋的形成。這個部位的幾個氨基酸側鏈深入PBG,參與對抗原肽的識別與結合。因此,我們推測,G組和D組BF2分子PBG中第2個7氨基酸基序的差異造成了其識別NDV抗原肽能力的不同。
　　其次,我們研究Ii免疫載體的免疫增強效應。I類分子交叉呈遞的發(fā)生在某種程度上是Ii依賴性的,而且,Ii和I類分子存在重要的功能相關性。Ii是M

7、HCII類分子的分子伴侶,它作為免疫載體在增強II類分子表位的呈遞效率中得到廣泛應用?；贗i通過CLIP占據(jù)I類分子PBG而與之結合,我們設計了兩種Ii突變體:Ii-O257和Ii-CT257。Ii-O257是Ii的CLIP被OVA的CTL表位(OVA257-264)替換形成的Ii-OVA嵌合體,Ii-CT257是C端截斷的Ii-O257,只包含它的第1-89位氨基酸。我們用這兩個嵌合體蛋白免疫小鼠,并以OVA257-264肽和OVA

8、蛋白為對照,然后用熒光定量PCR檢測不同組細胞因子的分泌水平。結果表明,免疫Ii-O257或Ii-CT257蛋白的小鼠比單獨的OVA257-264肽產(chǎn)生更高水平的細胞因子:IFN-γ分別增強11和13倍,IL-2分別增強9和11倍。共聚焦顯微鏡觀察和免疫共沉淀實驗顯示這兩個Ii-OVA突變體能在體內(nèi)和鼠MHCI類分子結合。截斷的Ii嵌合體Ii-CT257能與I類分子結合表明Ii作為免疫載體可應用于交叉呈遞,而且,其N端功能片段可能是其發(fā)