nonapeptide突變體制備及抗新城疫病毒活性研究

1、動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010, 31(9): 17 21 Progress in Veterinary MedicineNonapeptide 突 變 體 制 備 及 抗 新 城 疫 病 毒 活 性 研 究王曙陽(yáng)1, 4, 梁劍平2, 陳積紅1, 韓躍武4, 薄永恒3, 曹云飛3(1. 中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所 , 甘肅蘭州 730000; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所, 甘肅蘭州 730000;3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 甘肅蘭州

2、 730000; 4. 蘭州大學(xué), 甘肅蘭州 730000)摘 要: 以生物工程技術(shù)表達(dá)及 120 g/ L SDS PAGE 電泳純化 Nonapeptide 突變體, 取制備的 Nonapeptide 突變體進(jìn)行抗新城疫病毒( NDV)的雞胚試驗(yàn)、 雞體內(nèi)抗 NDV 試驗(yàn)。結(jié)果表明, 當(dāng) Nonapeptide 突變體基因產(chǎn)物濃度達(dá)4 g/ mL~ 6 g/ mL, 對(duì)雞胚保護(hù)率均達(dá)到 100%, 感染雞胚全部存活; Nonapep

3、tide 突變體基因產(chǎn)物濃度大于 4 g/ mL, 對(duì) NDV 有很好的抑制作用, 雞用藥后 3 d 體內(nèi)檢測(cè)不到 NDV, 低劑量組(2 g/ mL) 也有較好的抑制 NDV 作用, 雞用藥后 5 d 體內(nèi)檢測(cè)不到 NDV。Nonapeptide 突變體基因產(chǎn)物具有 NDV 多克隆抗體相似活性, 能夠抑制雞胚中和組織培養(yǎng)中 NDV 的繁殖, 具有中和、 抑制 NDV 吸附作用。關(guān)鍵詞: Nonapeptide 突變體; 新城疫病毒;

4、抗病毒活性中圖分類(lèi)號(hào): S852. 659. 5; S852. 4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 1007 5038( 2010) 09 0017 05雞新城疫是 由新城疫 病毒( Newcastle diseasevirus, NDV)引起的一種急性高度接觸性傳染病 [ 1] 。該病的特點(diǎn)是體溫升高、 呼吸困難、 嚴(yán)重腹瀉、 神經(jīng)紊亂及黏膜、 漿膜出血等敗血癥變化 [ 2] , 是對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重危害的病毒病, 疫苗免疫尚不完善, 抗

5、病毒化學(xué)藥物對(duì)本病效果不顯著, 故至今尚無(wú)有效治療藥物。Nonapeptide 是 Ramanujam P 等 [ 3] 利用噬菌體展示技術(shù)篩選出的九肽, 應(yīng)用抗體競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法表明,展示 Nonapeptid 的融合噬菌體能夠競(jìng)爭(zhēng) NDV 多克隆抗體在病毒上的結(jié)合位點(diǎn); 該研究組化學(xué)合成九肽(CT LTT KLYC) , 無(wú)論是環(huán)狀 還是線(xiàn)狀的 結(jié)構(gòu),都能夠抑制含 胚雞蛋 中和組 織培 養(yǎng)中 NDV 的增殖, 并且可以抑制溶血活性。相關(guān)的

6、九肽進(jìn)行氨基酸置換研究表明 8 位酪氨酸這一含苯環(huán)的極性中性氨基酸在肽與病毒的相互關(guān)系中起重要作用, 因?yàn)榉枷阕鍌?cè)鏈周?chē)碾娮釉瓶赡馨斜江h(huán)的 H 和羧酸的 O 或 H 與胺、 酰胺 的 N 之 間氫鍵的 形成。而氨基酸置換研究還表明 6 位賴(lài)氨酸在這一相互作用中并不起主要作用 [ 4] 。本試驗(yàn)選擇將 6 位賴(lài)氨酸置換為酪氨酸, 增加九肽中含苯環(huán)氨基酸的數(shù)目, 獲得突變體基因, 制備 Nonapeptide 抗菌肽突變體, 進(jìn)行體內(nèi)

7、抗 NDV 試驗(yàn)。用 Nonapeptide 突變體治療雞新城疫未見(jiàn)報(bào)道, 本試驗(yàn)為臨床防控雞新城疫提供理論依據(jù)。1 材料與方法1. 1 材料1. 1. 1 病毒與細(xì)胞 新城疫病毒 F48E9 毒株購(gòu)自中國(guó)獸藥檢察所; 10 mL/ L 雞紅細(xì)胞懸液采自健康公雞血液, 以枸櫞酸鈉抗凝, 用生理鹽水洗 3 次, 取沉淀紅細(xì)胞用生理鹽水稀釋而成 [ 5] 。1. 1. 2 試驗(yàn)動(dòng)物及單克隆抗體 10 日齡的 SPF 雞胚購(gòu)自生物制品研究所;

8、 28 日齡非免疫石歧雜黃雞購(gòu)自生物制品研究所雞場(chǎng), 15 日齡和 25 日齡各抽血 1 次檢測(cè)新城 疫抗體, 采用 B 微量法檢測(cè) NDV血凝抑制(Hemagglutination inhibition, HI)抗體效價(jià), 抗體陰性者用于試驗(yàn)。1. 2 方法1. 2. 1 Nonapeptide 及突變體制備1. 2. 1. 1 通過(guò)化學(xué)合成目的基因 本試驗(yàn)選擇將6 位賴(lài)氨酸置換為酪氨酸, 增加這一九肽中含苯環(huán)氨基酸的數(shù)目, 獲得突變

9、體基因。選擇大腸埃希菌偏愛(ài)的密碼子, 并在基因兩端加入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)、 蛋氨酸密碼子, 化學(xué)合成 Nonapeptide 突變體基因序列 [ 6] 。片段 1: EcoR 5 AAT TC AT GTGCACC CTG ACC ACC TAT CTG T AT T GC ATGTGCACC CTG ACC ACC T AT CT G TAT TGC* 收稿日期 基金項(xiàng)目 國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃( 63 計(jì)劃) ( 6 ); 甘肅省自然

10、科學(xué)基金( R Z ) 作者簡(jiǎn)介 王曙陽(yáng)( ) , 女, 甘肅慶陽(yáng)人, 副研究員, 碩士, 主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。: 2010 07 01 : 8 200 AA10A208 1 4 0710 J A027 : 1974-M . DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 5 000; 1. Nonapeptide 基因( 單鏈) ; 2. Nonapeptide M. DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1~ 2. Nonapeptide 表達(dá)重組質(zhì)

11、粒;基因( 雙鏈) ; 3. Nonapeptide 突變體基因( 雙鏈) 3~ 4. Nonapeptide 突變體基因表達(dá)重組質(zhì)粒M . DNA Marker DL 5 000; 1. Nonap eptide gen e( sin gle strand) ; M. DNA M ark er DL 2 000; 1 2. pGEX Nonapeptide;2. Non apeptide gene( double strand) ;

12、3. Nonapeptide mutant( double strand) 3 4. pGEX Nonapeptide mutant圖 1 目 的基因電泳結(jié)果 圖 2 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 1 Electroph or etic profile of target gene Fig. 2 Dig estion of recomb inan t ex pression plasmid with EcoRand SalM . DN

13、A 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1. 空白對(duì)照; 2. Nonapeptide 表達(dá)重組 M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1. GST Non apeptide 融合蛋白;質(zhì)粒; 3. Nonapeptide 突變體基因表達(dá)重組質(zhì)粒 2. GST Nonapeptide 突變體融合蛋白M . DNA M ark er DL 2 000; 1. Negative control; 2. pGEX Nonapeptide; M. Protein m

14、olecular weight marker; 1. Non apeptide3. pGEX Non apeptide mutant fu sion protein; 2. GST Nonapeptide mutant fusion pr otein圖 3 重組 表達(dá)質(zhì)粒的 PCR 鑒定 圖 4 經(jīng) SDS PAGE 純化的表達(dá)蛋白電泳圖譜Fig. 3 Identifiaction of recombinant expression p

15、lasmid by PCR Fig. 4 SDS PAGE profile of purified ex pressed products表 1 Nonapeptide 突變體蛋白對(duì)雞胚的最大無(wú)毒濃度測(cè)定結(jié)果T able 1 Th e maximum non tox ic concentration of Nonapeptide mutant protein in emb ryosNonapeptide 突變體濃度/ ( g # mL-