基因Ⅶ型新城疫病毒主要毒力蛋白功能研究及應用.pdf

1、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)的毒力由多個基因共同調控，這些基因主要包括F、HN、L和NP基因。本研究首先以基因Ⅶ型NDV F蛋白作為研究對象，對F蛋白的保守序列457-461位氨基酸進行單點突變，獲得不同的突變體蛋白。研究發(fā)現，突變體F蛋白與野生型F蛋白均可定位在細胞表面。除N460位點以外的其余4個F蛋白突變體在同型HN蛋白的協(xié)同作用下，可以顯著地增強細胞融合能力，表現為合胞體數量的增多和融合面

2、積的擴大;此外，單獨轉染F蛋白突變體質粒，發(fā)現T458位和G459位氨基酸的突變，可以不依賴于HN蛋白獨立誘導膜融合。通過反向遺傳操作技術，成功拯救了5株突變病毒，分別是rNDV-V457D、rNDV-T458D、rNDV-G459D、rNDV-N460D和rNDV-L461D，且獲救的毒株可穩(wěn)定傳代。NDV F基因突變病毒在DF-1細胞上的增殖速度和最高滴度均低于rNDV，其中，rNDV-T458D、rNDV-L461D與rNDV相比

3、，在感染24h時病毒滴度具有顯著差異(p＜005)，在感染40h和48h時，rNDV-T458D和rNDV-G459D與rNDV相比均具有極顯著差異(p＜001)，并且rNDV-T458D和rNDV-G459D的病毒毒力由強毒變?yōu)橹械榷玖?。此外，上述NDV F基因突變株感染SPF雞后分別檢測病毒在臟器和拭子中的含量，發(fā)現各突變株在不同組織樣品中的病毒滴度均低于rNDV，rNDV呈現全身性高病毒滴度分布，其中在脾臟和法氏囊中病毒含量最高，

4、小腸中也有較高的病毒滴度;而rNDV-T458D、rNDV-G459D和rNDV-L461D主要存在于免疫器官脾臟和法氏囊中，rNDV-V457D在小腸中病毒含量最高。因此，與rNDV相比，F蛋白的上述5個點突變降低了各突變株病毒在宿主體內的復制能力。
　　L蛋白是NDV中最大的結構蛋白，它除了具有5'端加帽、帽依賴的甲基化轉移酶活性及3，端添加多聚腺苷酸尾巴功能以外，還參與病毒基因組的轉錄和復制，與病毒的毒力緊密相關。對L蛋白的

5、保守結構域K-D-K-E進行突變，成功獲救了4株NDVL蛋白突變株，其病毒毒力顯著減弱，由強毒株均突變?yōu)槿醵局?，且突變病毒在DF-1細胞中的增殖能力低于rNDV。同時，將這4株病毒連續(xù)傳至15代，測序結果證明突變位點依然存在，可以穩(wěn)定遺傳。突變弱毒株免疫SPF雞21d后用基因Ⅶ型強毒NDV-74株攻毒，均可完全保護，其中rNDV-E1954Q組攻毒后，未檢測到病毒排毒。在此突變毒株的基礎上，構建了F蛋白突變的重組病毒rNDV-F+E19

6、54Q，該重組病毒的毒力顯著低于野生型NDV，免疫SPF雞21d后攻毒，亦可完全保護。攻毒后檢測排毒情況和臟器中病毒含量，發(fā)現各臟器中病毒載量及排毒量均低于LaSota免疫組。
　　此外，本研究缺失NP蛋白抗原表位的18個氨基酸和突變F蛋白裂解位點，構建基因Ⅶ型NDV負標記株，獲救的病毒具有毒力低、滴度高和免疫原性好等優(yōu)點。免疫SPF雞21d后攻毒，可完全保護，且排毒量和臟器病毒載量均低于LaSota對照組。本研究的結果為NDV新