新城疫病毒P基因編碼蛋白拮抗Ⅰ型干擾素信號通路的機(jī)制研究.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)強(qiáng)毒株引起的烈性、高度接觸性傳染病，在世界范圍內(nèi)流行，感染多種禽類，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。NDV基因組結(jié)構(gòu)為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，其中P基因能通過“RNA編輯”產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白P及非結(jié)構(gòu)蛋白V和W，P/V/W蛋白具有相同的氨基端和不同的羧基端。NDV V蛋白被認(rèn)為是毒力因子之一，與其IFN通路拮抗能

2、力有關(guān)，也與NDV溶瘤特性相關(guān)。
　　目前關(guān)于NDVV蛋白拮抗IFN信號具體機(jī)制的研究尚不多見，有研究表明V蛋白能通過降解STAT1(Signal transducer and activator of transcription1，STAT1)發(fā)揮阻斷IFN信號的作用。然而另一研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NDV感染細(xì)胞及V蛋白過表達(dá)細(xì)胞系中，STAT1蛋白能與V蛋白共存，暗示存在其他的IFN信號阻斷機(jī)制。為了進(jìn)一步研究V蛋白拮抗IFN信號的

3、具體機(jī)制，本文通過多種NDV毒株感染多種細(xì)胞，以及NDV真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等技術(shù)手段，檢測IFN信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平及磷酸化修飾水平，鑒定與之相關(guān)的病毒蛋白，闡明其作用機(jī)制。最終，利用V蛋白缺失株ZJ1-Vs對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。本研究的結(jié)果為NDV P基因編碼蛋白P/V/W在拮抗Ⅰ型IFN信號通路中的功能提供了新的見解。
　　1.三種基因型NDVP/V/W真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及多克隆抗體的制備
　　為獲得檢測V蛋白表達(dá)的抗

4、體，本研究通過擴(kuò)增NDV9a5b毒株V蛋白PNT結(jié)構(gòu)域和CTD結(jié)構(gòu)域，以及ZJ1毒株V蛋白CTD結(jié)構(gòu)域，連入原核表達(dá)載體pET-28a或pColdTF進(jìn)行原核表達(dá)，蛋白純化后免疫小鼠，獲得9a5b V蛋白和ZJ1 VCD多克隆抗體。同時利用Overlapping PCR構(gòu)建了9a5b、La Sota和ZJ1毒株V和W蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒。結(jié)果顯示，9a5b V蛋白多抗和ZJ1 VCD多抗反應(yīng)性良好，可用于V蛋白表達(dá)檢測。9a5b、La So

5、ta和ZJ1毒株V和W蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒也構(gòu)建成功并正確表達(dá)。NDV感染人源細(xì)胞系HeLa和禽源細(xì)胞系DF1后V蛋白表達(dá)存在宿主差異，易感宿主雞源DF1細(xì)胞中V蛋白表達(dá)量更高，而在哺乳動物細(xì)胞中，V蛋白并不能有效表達(dá)。
　　2.NDV V蛋白介導(dǎo)STAT1降解的毒株差異分析
　　為驗(yàn)證NDV對IFN信號通路中關(guān)鍵蛋白STAT1的作用，本實(shí)驗(yàn)使用9a5b、La Sota和ZJ1等NDV毒株感染和V蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa和V

6、ero細(xì)胞。Western-blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，比較轉(zhuǎn)染、感染單一作用或共同作用下，細(xì)胞內(nèi)STAT1的變化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NDV感染HeLa和Vero細(xì)胞STAT1降解不明顯，轉(zhuǎn)染V蛋白后也得到同樣的結(jié)果。有趣的是，只有在轉(zhuǎn)染V蛋白后感染NDV，STAT1才出現(xiàn)明顯的降解，且不同毒株之間存在差異。該結(jié)果表明，V蛋白對STAT1的降解作用受到毒株差異、感染后細(xì)胞生物學(xué)活動變化或其他病毒蛋白的影響。
　　3.NDVP基因編

7、碼蛋白對STAT1磷酸化水平的影響及反向遺傳毒株驗(yàn)證
　　根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測V蛋白可能通過其他途徑間接地誘導(dǎo)STAT1蛋白的降解。眾所周知，STAT1蛋白磷酸化是IFN信號通路激活的重要環(huán)節(jié)。為驗(yàn)證V蛋白是否與磷酸化STAT1(p-STAT1)相互作用，本研究通過外源IFN-α刺激，NDV感染及真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，泛素抑制劑處理，并最終通過反向遺傳V蛋白缺失株ZJ1-Vs驗(yàn)證，NDV V蛋白通過針對性介導(dǎo)p-STAT1蛋白發(fā)