泛素特異性蛋白酶25調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素信號通路的分子機制.pdf

1、病毒感染可以激活宿主的免疫系統(tǒng)，包括天然免疫防御系統(tǒng)和獲得性免疫應(yīng)答防御系統(tǒng)。天然免疫反應(yīng)主要發(fā)生在病毒感染的早期且與抗病毒感染緊密相關(guān)。干擾素作為重要的抗病毒因子，可清除病毒。細胞受到病毒刺激后，經(jīng)過一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致干擾素產(chǎn)生，進一步激活下游JAK-STAT信號途徑，誘導(dǎo)下游大量抗病毒基因的轉(zhuǎn)錄，最終起到抗病毒作用。泛素化作為一個重要的翻譯后修飾途徑，在調(diào)控病毒誘導(dǎo)的干擾素信號通路中起著至關(guān)重要的作用。
　　 蛋白泛素

2、化調(diào)節(jié)是一個可逆過程，細胞中還存在一些去泛素化蛋白酶（deubiquitinationenzymes，DUBs）進行逆向調(diào)節(jié)。去泛素化由DUBs介導(dǎo)，同樣在天然免疫反應(yīng)中起著重要的作用，近幾年更是人們研究的熱點。而泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specificproteases，USPs)作為DUBs中成員最多且結(jié)構(gòu)最具多樣性的一類半胱氨酸酶，以其結(jié)構(gòu)和功能的多樣性和復(fù)雜性受到了科研界的廣泛關(guān)注。近些年關(guān)于USPs的報道也層出不

3、窮，揭示了其廣泛的生物學(xué)活性。為了更加全面的了解這一家族的結(jié)構(gòu)和功能特征，本研究圍繞USP25的結(jié)構(gòu)和功能以及其在調(diào)控干擾素信號通路中的作用進行了深入的研究，具體研究內(nèi)容如下:
　　 1.USP25負調(diào)節(jié)仙臺病毒(SEV)誘導(dǎo)的干擾素刺激應(yīng)答元件(ISRE)的激活以及干擾素刺激基因(ISGs)的表達
　　 干擾素刺激應(yīng)答元件(IFN-stimulatedresponseelement，ISRE)作為干擾素刺激基因(int

4、erferon-stimulatedgenes，ISGs)啟動子調(diào)控區(qū)的應(yīng)答元件，可以啟動ISGs的轉(zhuǎn)錄，并在抗病毒中扮演著重要角色。本研究利用雙熒光素酶的方法對54個USPs干擾之后進行篩選，發(fā)現(xiàn)USP25顯著增強仙臺病毒(Sendaivirus，SEV)誘導(dǎo)的ISRE啟動子活性。進一步超表達USP25顯示其顯著抑制SEV誘導(dǎo)的ISRE啟動子活性，且呈劑量依賴性。Real-TimeRT-PCR結(jié)果表明USP25顯著抑制多種ISGs的轉(zhuǎn)

5、錄。表明USP25參與抗病毒天然免疫反應(yīng)。
　　 2.USP25負調(diào)控Ⅰ型干擾素信號通路的分子機制
　　 雙熒光素酶以及Real-TimeRT-PCR結(jié)果顯示USP25顯著下調(diào)SEV誘導(dǎo)的β干擾素(interferon-β，IFN-β)轉(zhuǎn)錄。進一步干擾USP25之后發(fā)現(xiàn)USP25表達下調(diào)顯著激活SEV誘導(dǎo)的IFN-β轉(zhuǎn)錄，表明USP25負調(diào)控SEV誘導(dǎo)的干擾素表達。
　　 干擾素表達需要干擾素調(diào)節(jié)因子3（inte

6、rferonregulatoryfactor3，IRF3）與核因子κB（nuclearfactor-kappaB，NF-κB）的活化以及共同作用。雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示USP25顯著抑制SEV誘導(dǎo)的IRF-3以及NF-κB的激活。Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP25同時抑制IRF-3以及p65的磷酸化。提示USP25通過抑制SEV誘導(dǎo)的IRF-3以及NF-κB的激活抑制IFN-β產(chǎn)生。
　　 3.USP25去泛素化活性檢測及

7、其去泛素化活性位點的鑒定
　　 USP25雖然屬于DUBs中的成員，但并不是所有的DUBs都具有去泛素化活性。經(jīng)純化或者體內(nèi)表達的USP25均能將K48或K63連接形式的泛素從泛素化蛋白上移除，表明USP25存在去泛素化活性。
　　 USPs含有保守的半胱氨酸盒(Cys-box)和組氨酸盒(His-box)，與天冬氨酸/天冬酰胺(Asp/Asn)一起構(gòu)成起催化作用的三聯(lián)殘基。通過氨基酸序列比對推測USP25的第178位C

8、（半胱氨酸）以及第607位H（組氨酸）為其去泛素化活性位點。為了驗證這一推測，進一步構(gòu)建了USP25突變體(C178A、H607A)的真核表達質(zhì)粒，Westernblot檢測結(jié)果證實第178位C（半胱氨酸）以及第607位H（組氨酸）確實為USP25的去泛素化活性位點。
　　 4.USP25的去泛素化活性參與其抑制Ⅰ型干擾素信號通路
　　 雙熒光素酶研究發(fā)現(xiàn)USP25喪失DUB活性后，其抑制IFN-β活性顯著喪失，表明US

9、P25的DUB活性參與其抑制SEV誘導(dǎo)的IFN-β轉(zhuǎn)錄。USP25顯著抑制甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（retinoicacid-inducedgene-Ⅰ，RIG-Ⅰ）、β-干擾素啟動子刺激物1(interferon-βpromoterstimulator1，IPS-1)、TNF受體相關(guān)因子2(TNFreceptor-assciatedfactor,TRAF2)以及TNF受體相關(guān)因子6(TNFreceptor-assciatedfactor,TRA