24633.泛素特異性蛋白酶usp2和usp8催化機(jī)制和底物特異性研究

1、學(xué)校代碼：—102—00分類(lèi)號(hào)：監(jiān)研究生學(xué)號(hào)：—1020020—0710246密級(jí)：五彭i雩亭磅I掌鼢，；、、：窆蘭：二／東牡，葒大季博士學(xué)位論文泛素特異性蛋白酶USP2和USP8催化機(jī)制和底物特異性研究TheStudyofcatalyticmechanismandsubstratespecificityofUbiquitinspecificityEnzymesUSP2andUSP8指導(dǎo)教師學(xué)科專(zhuān)業(yè)研究方向作者：張萬(wàn)方李玉新教授Robe

2、rtMenard教授細(xì)胞生物學(xué)蛋白酶結(jié)構(gòu)與功能東北師范大學(xué)學(xué)位評(píng)定委員會(huì)2011年5月摘要蛋白的去泛素化作用是翻譯后修飾，這一修飾作用通過(guò)影響被修飾蛋白的穩(wěn)定性、定位和功能等在很多細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。泛素與靶蛋白的結(jié)合是通過(guò)形成一個(gè)復(fù)合物來(lái)完成的，這是一個(gè)多步驟的級(jí)聯(lián)過(guò)程，至少需要三種酶的參與：泛素激活酶El，泛素接合酶E2和泛素連接酶E3，它們激活并轉(zhuǎn)移泛素及泛素類(lèi)似物到靶蛋白內(nèi)部的賴(lài)氨酸殘基的￡一氨基上。被結(jié)合上K48連接

3、泛素鏈的靶蛋白通過(guò)泛素蛋白酶體系統(tǒng)被降解，泛素的非蛋白酶體功能包括其它位置賴(lài)氨酸連接的多聚泛素鏈和單泛素化作用。泛素化作用是可逆的過(guò)程，泛素的羧基末端甘氨酸與靶蛋白的賴(lài)氨酸殘基連接的異肽鍵，或者是其它的在多聚泛素鏈中的泛素分子能夠被去泛素化酶切除掉。這種酶也作用于泛素及泛素類(lèi)似物的前體產(chǎn)生出有活性的泛素及泛素類(lèi)似物。在哺乳動(dòng)物中的大約有100種DUBs已經(jīng)在人體基因組中得到鑒定。DUBs可以分為五個(gè)不同的家族，其中有四個(gè)家族是半胱氨酸蛋

4、白酶，它們是：泛素C末端水解酶(UCH)、泛素特異性蛋白酶(USP)、卵巢癌相關(guān)蛋白酶(OTU)和MachadoJosephdomain(MJD)DUBs。USPs是一個(gè)家族成員最多、結(jié)構(gòu)差異最大的去泛素化酶亞家族，許多USPs都有重要的生物學(xué)作用，是腫瘤干擾治療的重要潛在靶標(biāo)。USP的催化結(jié)構(gòu)域與抑制劑Ubal復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)分析指出，三個(gè)保守的氨基酸殘基Cys、His和推測(cè)的第三個(gè)保守氨基酸殘基Asp或Asn組成催化三聯(lián)體，它們是由

5、四面體瞬間結(jié)構(gòu)形成的氧離子洞中間的水分子橋來(lái)穩(wěn)定的。本研究通過(guò)表達(dá)USP2和USP8的催化結(jié)構(gòu)域，點(diǎn)突變分析了催化位點(diǎn)殘基在水解肽鍵和異肽鍵底物中的作用，由于異肽鍵底物K48連接的DiUb沒(méi)有熒光因子標(biāo)記，因此我們引入了質(zhì)譜分析檢測(cè)催化過(guò)程。USP2在分解DUBs的通用底物L(fēng)ibAMC時(shí)，催化位點(diǎn)的突變體對(duì)酶的活性沒(méi)有產(chǎn)生影響。對(duì)游離的USP2以及USP2與底物四面體瞬間結(jié)構(gòu)復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬實(shí)驗(yàn)得出，在乙酰化作用步

6、驟中Asn218在結(jié)構(gòu)上直接穩(wěn)定氧離子，同時(shí)它受到臨近的氨基酸殘基Asp482的支持。突變實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)酶的催化特異性并不依賴(lài)于底物間化學(xué)鍵即肽鍵或異肽鍵的性質(zhì)，而是在于底物本身。另外我們還發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基Asn481結(jié)構(gòu)上處于催化三聯(lián)體第三位成員的位置，但是它卻不能獨(dú)自完成該功能。雙突變和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)保守氨基酸殘基Asp482與Asn481協(xié)同作用維持結(jié)構(gòu)正確的排列和穩(wěn)定His464的質(zhì)子化作用。USP8的結(jié)果與USP不盡相同，在分解通用底