雙特異性抗體與抗體融合蛋白

1、雙特異性抗體,2,雙特異性抗體,概述構建策略應用,3,概述,雙特異性抗體：抗體兩個結合點表現為不同的特異性，即分別結合不同表位。如，一個結合靶細胞（如腫瘤細胞），另一結合藥物或免疫效應細胞（如蓖麻毒素、抗癌藥物、細胞毒性細胞）,4,雙特異性抗體,5,,6,雙特異性抗體的功用：提高療效，減少副作用。主要用于靶向治療。,7,構建策略,雙特異性抗體的靶標 一個結合治療靶標，另一個指向體內效應細胞T細胞 TCR

2、CD3 CD2,8,構建策略,雙特異性抗體的靶標 一個結合治療靶標，另一個指向體內效應細胞吞噬細胞/APC FcγR、CR,9,構建策略,雙特異性抗體的靶標 一個結合治療靶標，另一個指向體內效應細胞NK細胞 FcγR、CD56,10,雙特異性抗體的效應靶,11,構建策略,雙特異性抗體的構建方法雜化雜交瘤技術 將具有某種特異性（如抗瘤細胞）的McAb細胞株與具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）

3、的小鼠脾細胞進行融合，即產生出雜化雜交瘤細胞株的二價瘤體。,12,雜化雜交瘤技術產生的雙特異性抗體,13,雜化雜交瘤分泌的抗體形式 保持原特異性抗體分子： L1H1-H1L1，L2H2-H2L2 重鏈特異性相同的配對抗體分子： L1H1-H1L2，L1H2-H2L1 L2H1-H1L2，L1H2-H2L2 重鏈、輕鏈特異性不同的配對抗體分子： L1H1-H2L2，L1H2-H1L

4、2 L1H1-H2L1，L2H2-H1L2,14,只有L1H1-H2L2才是所需的雙特異性抗體,15,雜化雜交瘤方法的不足 產量低，僅占10% 產物需篩選，費時費力 瘤株不穩(wěn)定,16,構建策略,雙特異性抗體的構建方法化學交聯法 Nisonoff和Rivers最早開始研究 化學交聯無需經過細胞融合，比較簡便易行。 通常利用重鏈與輕鏈這間的二硫鏈經還原和再氧化，將兩種不同特異性抗體的半分子結合

5、在一起?；蛴秒p功能交聯劑，如鄰苯酸酯等，把兩個抗體半分子交聯在一起。,17,化學交聯的雙特異性抗體,18,構建策略,雙特異性抗體的構建方法化學交聯法 用于制備雙功能抗體的McAb可以是完整分子，也可是經胃酶水解獲得F（abˊ）2片段。后者在減少鼠源免疫原性方面，效果較好。,19,構建策略,雙特異性抗體的構建方法基因工程技術 利用分子生物學技術設計產生雙功能抗體 常見有四種構建形式，多為小分子抗體。,20,末端半胱氨

6、酸殘基（Cys）共價交聯 在兩種scFv分子C末端分別帶上自由的Cys，通過常規(guī)二硫鍵共價交聯，形成雙特異性抗體,,,21,單鏈雙特異性抗體 將兩種scFv分子基因用linker連接在一起，然后表達形成雙特異性抗體,,22,微型雙特異性抗體 利用專門二聚化結構將兩種scFv分子連接在一起，形成雙特異性抗體 如利用fos和jun基因的亮氨酸拉鏈序列：,,23,雙體型雙特異性抗體 將兩種不同抗體的V

7、H和VL用較短的linker連接形成兩種不同單鏈，當它們共表達時，其相互間連接在一起，形成雙特異性抗體 1993，Holliger,24,雙特異性抗體的應用,免疫診斷腫瘤放射顯影腫瘤藥物殺傷腫瘤的免疫殺傷乳腺癌、淋巴母細胞白血病、神經膠質瘤,25,抗體免疫偶聯物,26,抗體免疫偶聯物,概述小分子藥物與抗體偶聯物毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯物應用,27,概述,抗體免疫偶聯物將單抗與“彈頭”藥物偶聯在一起，以提高藥

8、物作用的特異性，主要用于腫瘤治療。如，Mylotarg—抗CD33單抗偶聯加里奇霉素，治療老年人急性髓細胞性白血病，2000年上市。,28,與單抗偶聯的常用“彈頭”藥物,29,小分子藥物與抗體偶聯物,一個單抗可偶聯一個至數十個小分子藥物。 抗體分子中的多個基團可以用于連接，如巰基，氨基，羥基，胍基，羧基，糖基等。,30,小分子藥物與抗體偶聯物,直接偶聯物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的

9、交聯劑。2-亞胺四氫噻吩(2-IT)可在具氨基的化合物上引入巰基,31,小分子藥物與抗體偶聯物,直接偶聯物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯劑。SPDP(N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯)可將巰基引入抗體 如，阿霉素與抗子宮內膜腺癌單抗偶聯，效果提高57倍,32,小分子藥物與抗體偶聯物,直接偶聯物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯

10、劑。PDPH(3-(2-吡啶二硫基)-丙酰肼)可將巰基引入抗體,33,小分子藥物與抗體偶聯物,直接偶聯物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯劑。戊二醛可將藥物與單抗的伯氨基僑聯 如，柔紅霉素與單抗偶聯,34,小分子藥物與抗體偶聯物,直接偶聯物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯劑?；顫婖タ蓪⒑然幬锱c抗體的氨基相偶聯,35,小分子藥物與抗體偶

11、聯物,間接偶聯物 將藥物先與大分子載體相連，然后大分子載體再偶聯到單抗。Poly-Lys可將含羧基的小分子藥物偶聯到載體。,36,小分子藥物與抗體偶聯物,間接偶聯物 將藥物先與大分子載體相連，然后大分子載體再偶聯到單抗。Poly-Glu可將含氨基的小分子藥物偶聯到載體。,37,小分子藥物與抗體偶聯物,間接偶聯物 將藥物先與大分子載體相連，然后大分子載體再偶聯到單抗。Dextran可將含氨基的小分子藥物偶聯到載體。

12、 如，將平陽霉素與抗乳腺癌/肝癌單抗偶聯,38,小分子藥物與抗體偶聯物,間接偶聯物 將藥物先與大分子載體相連，然后大分子載體再偶聯到單抗。脂質體脂質體與藥物融合，再與抗體連接成免疫脂質體 如，阿霉素,39,小分子藥物與抗體偶聯物,偶聯要點與存在問題小分子藥物與單抗偶聯應有一定空間距離需提高偶聯產率偶聯基團應避開藥物活性基團保留單抗靶向性多個藥物分子偶聯簡單，易重復不形成抗體、藥物或偶聯物聚合物,40,毒素

13、及大分子多肽藥物與抗體偶聯物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。同型雙功能偶聯劑 具有兩個相同反應功能基團。雙功能異氰酸酯親脂性偶聯劑 如，將白喉毒素與抗瘤單抗偶聯,41,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。同型雙功能偶聯劑 具有兩個相同反應功能基團。脂肪二醛通過其醛基與藥物/單抗的氨基偶聯,42,毒素及

14、大分子多肽藥物與抗體偶聯物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。同型雙功能偶聯劑 具有兩個相同反應功能基團。二馬來酰亞胺衍生物巰基偶聯劑,43,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。同型雙功能偶聯劑 具有兩個相同反應功能基團。特點與不足步驟簡單，流程短。副反應產物多，均一性差，產率低。,44,毒素及大分子多肽藥物

15、與抗體偶聯物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。異型雙功能偶聯劑 具有兩個不同反應功能基團。SPDP先與抗體（藥物）氨基反應形成化合物，再與藥物（抗體）巰基反應形成偶聯物。 如，相思豆毒素、蓖麻毒素、力達霉素與抗瘤單抗偶聯,45,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。異型雙功能偶聯劑 具有兩個不同反應功能基團。

16、苯丁酸氮芥衍生物先與抗體氨基反應形成化合物，再與藥物氨基反應形成偶聯物。,46,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。異型雙功能偶聯劑 具有兩個不同反應功能基團。馬來酰亞胺活潑酯先與藥物氨基反應形成化合物，再與抗體巰基反應形成偶聯物。,47,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。異型雙功能

17、偶聯劑 具有兩個不同反應功能基團。特點反應溫和，易控制，產物均一性好，產率高。,48,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。免疫偶聯物的純化 由于反應產物是混合物，故需進行分離純化 常用方法有:凝膠過濾、親和層析、離子交換層析、高效液相色譜。,49,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯物,研究趨勢連接可控性，高產率，高產物均一性。選擇性連接抗體和藥物

18、某一特定基團偶聯物在體內穩(wěn)定循環(huán)，并能在腫瘤部位激活或釋放,50,抗體偶聯藥物的研究與應用,51,單抗-藥物的臨床腫瘤治療試驗,52,抗體偶聯藥物的研究與應用,單抗-毒素的臨床試驗研究廣泛，具一定效果，但與期望尚有距離。,53,單抗-毒素的臨床腫瘤治療試驗,54,抗體融合蛋白,55,抗體融合蛋白,概述重組免疫毒素基因工程抗體-酶基因工程抗體-細胞因子抗體-超抗原免疫粘連素,56,概述,抗體融合蛋白將抗體（片段）與其它效應

19、蛋白基因融合，構建融合表達載體，然后在合適的表達系統(tǒng)生產融合蛋白。融合蛋白具均一性，易生產,57,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達重組免疫毒素的構建常用毒素白喉毒素及其衍生物 白喉桿菌所產生，修飾延長因子,阻斷蛋白合成 毒性極強,1-2個分子即可殺死1個細胞。 腫瘤細胞敏感 體內水解為A/B兩片段，A為毒性部分，B為結合部分,58,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達重組免疫毒素的構建

20、常用毒素假單胞桿菌外毒素及其衍生物 不可逆修飾延長因子,阻斷蛋白合成 毒性很強 單鏈，分結合部與毒性部位,59,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達重組免疫毒素的構建常用毒素蓖麻毒素及其衍生物 滅活核糖體，抑制蛋白合成 體內水解為A/B兩鏈,A為毒性部分,B為結合部分,60,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達重組免疫毒素的構建構建重組免疫毒素 常用抗體片段的C端與毒素融合,61

21、,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達臨床試驗與研究血液惡性腫瘤靶向IL-2受體的免疫毒素 多數T/B細胞型白血病與淋巴瘤都過度表達IL-2受體亞基CD25 如，抗CD25單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物 （臨床）,62,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達臨床試驗與研究血液惡性腫瘤靶向CD22的免疫毒素 約70%B細胞型淋巴瘤和白血病為CD22陽性 如，抗CD22單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物

22、 （臨床前）,63,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達臨床試驗與研究血液惡性腫瘤其他靶向血液抗原的免疫毒素 CD19,CD6,CD30,CD33,CD46,64,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達臨床試驗與研究實體瘤抗Lewis Y重組疫毒素 Lewis Y存在于結腸癌，乳腺癌，胃癌，肺癌，膀胱癌表面。 如，抗Lewis Y單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物，對結腸癌和乳腺癌有確切療效。,6

23、5,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達臨床試驗與研究實體瘤抗Her2/neu重組疫毒素 Her2/neu 在乳腺癌，肝癌，卵巢癌，胃癌，有高表達。 抗Her2單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物(臨床),66,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達存在問題特異性非特異性毒性血管滲漏—內皮細胞損傷免疫原性實體瘤滲透,67,基因工程抗體-酶,把單抗分子與酶融合表達，使特定的催化效應靶向特定的

24、部位?？贵w介導的酶-前藥療法 酶集中于靶標部位，催化無或低活性的抗癌前藥轉化為胞毒性藥物，從而發(fā)揮藥物特異性釋放、活化，提高療效?？笴EA抗體-β-葡萄苷酸酶前藥—doxorubicin葡萄苷酸衍生物療效顯著提高,68,基因工程抗體-酶,把單抗分子與酶融合表達，使特定的催化效應靶向特定的部位?？贵w介導的酶-前藥療法抗p97抗體-β-內酰胺酶P97—黑瘤抗原前藥—7-(4-羧基丁酰胺)-頭孢菌素氮芥療效較化學

25、偶聯物顯著提高,69,基因工程抗體-酶,把單抗分子與酶融合表達，使特定的催化效應靶向特定的部位?；诤怂崦傅娜诤系鞍?核酸酶與單抗融合，靶向腫瘤細胞核糖核酸酶免疫毒素多種核糖核酸酶具抗瘤活性如，牛胰/牛精核糖核酸酶,70,基因工程抗體-酶,把單抗分子與酶融合表達，使特定的催化效應靶向特定的部位。靶向溶栓劑 血纖溶酶原激活劑與單抗融合，靶向凝血塊 如，尿激酶血纖溶酶原激活劑/組織血纖溶酶原激活劑與血塊單抗融合,

26、71,基因工程抗體-細胞因子,把單抗分子與細胞因子融合表達，發(fā)揮抗腫瘤作用。抗體-IL-2 抗黑瘤抗體-IL-2 臨床前試驗效果顯著，已進入臨床試驗,72,基因工程抗體-細胞因子,把單抗分子與細胞因子融合表達，發(fā)揮抗腫瘤作用。抗體-GM-SCF 強化腫瘤特異性免疫,73,基因工程抗體-細胞因子,把單抗分子與細胞因子融合表達，發(fā)揮抗腫瘤作用。抗體-IL-12 增強CD8+T細胞和NK細胞活性。,74,基因工程

27、抗體-細胞因子,把單抗分子與細胞因子融合表達，發(fā)揮抗腫瘤作用。抗體-B7 增強腫瘤特異性免疫,75,基因工程抗體-超抗原,常用超抗原SEA 葡萄球菌腸毒素，可激活大量T細胞，產生極強免疫應答。,76,基因工程抗體-超抗原,抗體-SEAFab-SEA 黑色素瘤動物實驗，明顯延長實驗動物生存時間?？笴D19-SEA B細胞白血病動物實驗，療效顯著。,77,基因工程抗體-超抗原,抗體-SEA抗結