中藥虎杖抗原、抗體制備及其特異性檢測(cè).pdf

1、目的：利用免疫學(xué)的方法制備中藥虎杖各成分的抗原、抗體并進(jìn)行特異性檢測(cè)。
　　 方法：首先分別制備虎杖的全成分抗原，然后分別應(yīng)用琥珀酸酐法、重氮化對(duì)氨基苯甲酸法以及改良的重氮化對(duì)氨基苯甲酸法將標(biāo)準(zhǔn)品大黃素與小牛血清白蛋白（BSA）連接，用以上各抗原免疫昆明小鼠，制備抗血清。
　　 結(jié)果：⑴用紫外分光光度計(jì)掃描大黃素、BSA、PBS、大黃素-BSA1、大黃素-BSA2和大黃素-BSA3。⑵用醋酸纖維濾紙雙向免疫擴(kuò)散法，取虎杖

2、水提液（含所有虎杖成分抗原）1：10作抗原，與各組抗血清反應(yīng)，檢測(cè)抗血清效價(jià)，判定各組抗原的免疫原性。在虎杖粗提抗原各組中，虎杖水提醇沉物組抗血清的抗體效價(jià)最高為1：16，即免疫原性最強(qiáng)；其次虎杖水提液組為1：4，免疫原性較弱；虎杖水提醇沉上清組為1：2，免疫原性相對(duì)最弱。在純提大黃素抗原各組中，抗體效價(jià)依次為大黃素-BSA3組為1：8、大黃素-BSA2組為1：4、大黃素-BSA1組為1：2。因此，可以判定大黃素-BSA3組免疫原性最強(qiáng)

3、，大黃素-BSA1組免疫原性相對(duì)較弱；單純大黃素沒有免疫原性。⑶選擇大黃素不同基團(tuán)與BSA連接，必然影響半抗原的表達(dá)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生不同的抗原表位，免疫動(dòng)物必然影響其免疫原性和抗體的特異性。采用Western印跡改良法檢測(cè)大黃素-BSA不同連接法免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體對(duì)相似結(jié)構(gòu)大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚特異性或交叉反應(yīng)的反應(yīng)性。用琥珀酸酐法連接的大黃素-BSA1組產(chǎn)生的抗大黃素抗體，除了與大黃素結(jié)合外，也能與大黃素甲醚、大黃酚發(fā)生交叉反應(yīng)；

4、而用重氮化對(duì)氨基苯甲酸法連接的大黃素-BSA2組產(chǎn)生的抗大黃素抗體，僅與大黃素特異性結(jié)合，不與大黃素甲醚、大黃酚發(fā)生交叉反應(yīng)；用改良的重氮化對(duì)氨基苯甲酸法連接的大黃素-BSA3組產(chǎn)生的抗大黃素抗體，與大黃素高度結(jié)合，與大黃素甲醚、大黃酚發(fā)生可疑性交叉反應(yīng)。但三者均不與大黃酸發(fā)生交叉反應(yīng)。⑷中藥大分子成分（如中藥蛋白、多糖等），可直接刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體，但在理論上講，小分子半抗原成分不能直接刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：虎杖粗提液（包括虎杖水

5、提液、虎杖水提醇沉物、虎杖水提醇沉上清）免疫小鼠，均產(chǎn)生了不同程度的抗大黃素抗體、抗大黃酸抗體、抗大黃素甲醚抗體和抗大黃酚抗體。其中以虎杖水提醇沉物組產(chǎn)生的抗體最全面和效價(jià)最高。但直接用純化的大黃素免疫，不產(chǎn)生抗體。⑸分別用虎杖粗提液和與其遺傳上相差甚遠(yuǎn)、不含有相同成分的白花蛇草水提液免疫小鼠，制備抗血清。通過醋酸纖維濾紙雙向免疫擴(kuò)散法檢測(cè)其抗體特異性，結(jié)果見表5。各組抗虎杖粗提液抗血清只與虎杖水提液發(fā)生反應(yīng)，與大黃水提液發(fā)生輕度交叉反

6、應(yīng)，但均不與白花蛇草水提液發(fā)生反應(yīng)；白花蛇草水提液抗血清只與白花蛇草發(fā)生反應(yīng)，均不與虎杖水提液發(fā)生反應(yīng)。
　　 結(jié)論：①琥珀酸酐法連接的大黃素-BSA復(fù)合物，免疫小鼠產(chǎn)生的抗體，不僅與大黃素結(jié)合，也能與大黃素甲醚、大黃酚交叉結(jié)合。②同一種連接方法，連接到載體的半抗原的量（即結(jié)合比），在一定范圍內(nèi)，結(jié)合比越高，半抗原的免疫原性就越大。影響其免疫原性除了與其結(jié)合比有關(guān)外，更與其連接方法有關(guān)，這可能與不同連接法對(duì)大黃素的抗原表位結(jié)構(gòu)的

7、免疫原性和大黃素.BSA復(fù)合物形成的半抗原的抗原表位種類和數(shù)量有關(guān)。③虎杖粗提液免疫小鼠制備的抗血清，能與虎杖水提液發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，不與無關(guān)的白花蛇草水提液發(fā)生反應(yīng)。證實(shí)其抗體具有種屬特異性。它能與同屬科大黃水提液發(fā)生輕度的交叉反應(yīng)，這與同一科屬的虎杖和大黃在遺傳上具有一定的同源性，含有同源性蛋白和共同小分子成分有關(guān)。④用虎杖粗提液免疫小鼠，可產(chǎn)生不同程度的抗小分子成分抗體（如抗大黃素抗體、抗大黃酸抗體、抗大黃素甲醚抗體和抗大黃酚抗體