副溶血性弧菌特異性抗體的制備研究.pdf

1、副溶血性弧菌是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，是近幾年來(lái)引起食物中毒事件的最主要微生物之一。副溶血性弧菌主要存在于海水、魚(yú)、蝦、貝類(lèi)等海產(chǎn)品中，其引起的食物中毒臨床上以腹痛、嘔吐、腹瀉等為主要癥狀。
　　 溶血毒素是副溶血性弧菌的主要致病因子。TLH、TDH和TRH是副溶血性弧菌分泌的三種主要溶血毒素，分別由tlh、tdh和trh基因編碼。其中TLH為副溶血性弧菌所特有，而TDH、TRH與其致病性緊密相關(guān)。
　　 為了給建立副溶

2、血性弧菌的免疫學(xué)檢測(cè)平臺(tái)的建立提供材料基礎(chǔ)，本研究分別以重組的副溶血性弧菌溶血毒素和滅活菌體為抗原制備副溶血性弧菌特異性抗體。
　　 一、副溶血性弧菌主要溶血毒素原核表達(dá)體系的構(gòu)建
　　 本文通過(guò)克隆重組構(gòu)建了副溶血性弧菌主要溶血毒素TLH、TDH和TRH原核表達(dá)載體pET30a/tlh、pET30a/tdh和pET30a/trh，并將它們轉(zhuǎn)入E.coliBL21中誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白His-TLH、His-TDH和His

3、-TRH，成功構(gòu)建了TLH、TDH和TRH原核表達(dá)體系。
　　 二、副溶血性弧菌特異性單克隆抗體的制備
　　 首先以TDH重組蛋白為純化對(duì)象，從純度、回收率以及免疫原性方面比較分析了重組表達(dá)蛋白的鎳柱親和層析法和割膠回收法。結(jié)果顯示利用割膠回收法純化所得重組蛋白純度高且具有較好的免疫原性。因此本文利用割膠回收法純化了TLH、TDH和TRH重組表達(dá)蛋白抗原。通過(guò)免疫、融合與克隆篩選，最終成功分別獲得了TLH和TDH的特異性

4、抗體細(xì)胞株各1株。經(jīng)特異性分析，兩株抗體細(xì)胞株分泌的TLH-DB2和TDH-AC12單克隆抗體對(duì)各自抗原的特異性反應(yīng)良好，但為實(shí)現(xiàn)直接檢測(cè)副溶血性弧菌培養(yǎng)上清的目的。
　　 三、副溶血性弧菌特異性多抗的制備
　　 以紫外滅活的副溶血性弧菌菌體為抗原，經(jīng)免疫、效價(jià)檢測(cè)、純化，最終獲得了副溶血性弧菌的多克隆抗體。多抗的ELISA檢測(cè)結(jié)臬顯示制備所得多抗對(duì)副溶血性弧菌具有較強(qiáng)的特異性反應(yīng)，同時(shí)對(duì)單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、銅

5、綠假單胞菌也有較弱的交叉反應(yīng)。
　　 四、副溶血性弧菌特異性抗體的應(yīng)用可行性
　　 本文以制備所得抗體為材料制備了免疫磁珠，對(duì)副溶血性弧菌的決速富集和TLH重組蛋白的快速檢測(cè)進(jìn)行了初步的應(yīng)用探討。結(jié)果顯示，以本研究制備的兔抗血清建立的IMS-PCR檢測(cè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)副溶血性弧菌的快速分離檢測(cè)，在未優(yōu)化的情況下，該法的副溶血性弧菌檢測(cè)限約為103CFU；以TLH-DB2單克隆抗體建立的免疫層析試紙條檢測(cè)法可以檢測(cè)TLH重組