洪湖碘泡蟲抗體的制備及其特異性研究.pdf

1、本研究對異育銀鯽“喉孢子蟲病”病原—洪湖碘泡蟲(Myxobolus honghuensis Liuet Gu，2012)的免疫原性進(jìn)行了一系列研究，制備出多克隆抗體和單克隆抗體。旨在為建立準(zhǔn)確、高效的洪湖碘泡蟲免疫學(xué)檢測方法提供有效工具以及疫苗的開發(fā)提供重要候選抗原信息，從而為“喉孢子蟲病”的免疫學(xué)防控打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.洪湖碘泡蟲多克隆抗體的制備及免疫特性分析本研究利用蔗糖密度梯度離心法分離純化洪湖碘泡

2、蟲，經(jīng)反復(fù)凍融、液氮研磨提取可溶性蛋白，免疫小鼠制備得到多克隆抗體，并采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFAT)、免疫印跡分析(Western blotting)對多克隆抗體的免疫特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，間接ELISA法測定多抗血清的效價(jià)為1∶25600; IFAT熒光定位顯示洪湖碘泡蟲的抗原主要位于極絲、孢子殼瓣的四周及底部一特定位置;Western blotting印記分析顯示該多抗血清與洪湖碘泡蟲可溶性蛋白

3、中約10條帶發(fā)生反應(yīng)，該可溶性蛋白中具有免疫原性的蛋白分子量大小分別約為180kDa,130kDa,78kDa,75kDa,62kDa,52kDa,42kDa,36kDa,34kDa,28kDa。該多抗血清與碘泡蟲屬及單極蟲屬的一些粘孢子蟲種類存在一定程度的交叉反應(yīng)。
　　2.洪湖碘泡蟲殼瓣和極絲單克隆抗體的制備與鑒定本研究利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)最終篩選得到兩株有效抗洪湖碘泡蟲的單克隆抗體1C7和3B7。結(jié)果顯示，間接ELISA

4、法測定效價(jià)分別為1∶124000、1∶248000，1C7和3B7的亞型分別為IgM和IgG1;IFAT定位抗原:單抗1C7特異識別極絲，單抗3B7特異識別成熟孢子殼瓣，兩者均不與蟲體其它結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng);Westernblotting顯示:1C7結(jié)合抗原的相對分子質(zhì)量約為130Kda和180Kda，3B7結(jié)合抗原的相對分子質(zhì)量約為28Kda。通過對兩株單抗所結(jié)合的蛋白進(jìn)行MS質(zhì)譜分析并與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(UniProt)比對的結(jié)果顯示:1C7