基于雙特異性抗體的熱帶傳染病快速偵檢方法的研究.pdf

1、熱帶傳染病是威脅我軍指戰(zhàn)員身體健康的重要疾病。部隊(duì)官兵熱帶傳染病自我防護(hù)意識(shí)比較薄弱且進(jìn)入新環(huán)境因缺乏免疫力等而極易感染熱帶傳染病。由于部隊(duì)執(zhí)行多樣化的軍事任務(wù)，迫切需要建立熱帶傳染病偵檢、診治和防控相關(guān)技術(shù)，應(yīng)對(duì)熱帶傳染病的威脅。瘧疾屬于蟲媒傳染病，由瘧原蟲寄生人體紅細(xì)胞引起，被WHO列入的8大熱帶病之一，廣泛分布于熱帶亞熱帶地區(qū)，且近年來瘧原蟲對(duì)抗瘧藥普遍具有抗藥性，潛在危害極大。恙蟲病是由恙蟲病東方體感染人體而引起的蟲媒傳染病，近

2、年來在我國的流行區(qū)域有不斷擴(kuò)大延伸的趨勢(shì)。我國南海島嶼地處熱帶，常年多雨，溫暖潮濕，是各種病原體滋生的溫床，有調(diào)查顯示該地區(qū)大部分區(qū)域是恙蟲病的疫源地。由于駐守海島的部隊(duì)多為外來人群，對(duì)該類傳染病的免疫力低，發(fā)病率較高，嚴(yán)重影響了部隊(duì)各項(xiàng)任務(wù)的完成，是我國南方戰(zhàn)區(qū)造成非戰(zhàn)斗減員的重要傳染病。
　　部隊(duì)軍事作業(yè)及戰(zhàn)時(shí)的特點(diǎn)都要求建立快速、便捷、無需或較少借助儀器的診斷方法。為了建立這樣一種滿足現(xiàn)場(chǎng)使用要求的熱帶傳染病快速偵檢方法，我

3、們引入了基因工程雙特異性抗體BsAb，它是將兩種針對(duì)不同抗原的單克隆抗體A和B的重、輕鏈可變區(qū)以非共價(jià)鍵、共價(jià)鍵或亮氨酸拉鏈、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域連接形成的重組抗體分子。利用基因工程雙特異性抗體可同時(shí)結(jié)合兩種不同的抗原的特性，如構(gòu)建抗人紅細(xì)胞/抗病原體抗原的雙特異性抗體，該BsAb可同時(shí)分別結(jié)合人紅細(xì)胞和血液中病原體，形成可見的紅細(xì)胞的集聚，從而對(duì)病原體感染做出診斷檢測(cè)。
　　本課題在制備了抗惡性瘧原蟲裂殖子表面抗原、抗

4、恙蟲病東方體外膜抗原以及抗人紅細(xì)胞膜表面非凝集抗原的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過RT-PCR分別獲得cDNA，以其為模板，利用設(shè)計(jì)的多對(duì)引物PCR擴(kuò)增得到各單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)目的基因片段VH、VL。設(shè)計(jì)拼接引物，利用重疊延伸PCR法，將抗瘧原蟲裂殖子表面抗原的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)目的基因片段通過連接肽序列拼接得到抗-瘧原蟲裂殖子表面抗原的單鏈抗體scFv目的基因片段;將抗人紅細(xì)胞膜表面非凝集抗原的單克隆抗體的重鏈

5、和輕鏈可變區(qū)目的基因片段與抗恙蟲病東方體外膜抗原的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)目的基因片段通過兩個(gè)短連接肽序L10(SAKTTPKLGG)和一個(gè)長(zhǎng)連接肽序列LL(RADAAAA(G4S)4)拼接得到抗-人紅細(xì)胞膜表面非凝集抗原/抗-恙蟲病東方體外膜抗原的雙特異性抗體BsAb目的基因片段。同時(shí)分別在其N端引入畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中信號(hào)肽前導(dǎo)序列，在其C端引入6×His標(biāo)簽序列。將這些基因片段分別克隆至畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPIC9K，電轉(zhuǎn)

6、化畢赤酵母菌GS115并誘導(dǎo)表達(dá)，先通過SDS-PAGE電泳分析確定疑似目的蛋白條帶后，再應(yīng)用Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。獲得的確定有目的蛋白表達(dá)的上清后續(xù)可經(jīng)鎳柱純化得到電泳純重組抗體。
　　本研究中，我們通過重疊延伸PCR獲得抗-瘧原蟲裂殖子表面抗原的單鏈抗體scFv和抗-人紅細(xì)胞膜表面非凝集抗原/抗-恙蟲病東方體外膜抗原的雙特異性抗體BsAb目的基因片段。將抗-瘧原蟲裂殖子表面抗原的單鏈抗體scFv克隆至畢赤

7、酵母分泌表達(dá)載體pPIC9K上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)分析重組蛋白的表達(dá)，得到的重組蛋白大小與理論分子量相符。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該單鏈抗體可與瘧原蟲裂殖子表面蛋白識(shí)別并結(jié)合，從而檢測(cè)到瘧原蟲感染，具有與親本抗體相似的識(shí)別結(jié)合能力。將抗-人紅細(xì)胞膜表面非凝集抗原/抗-恙蟲病東方體外膜抗原的雙特異性抗體重組基因片段克隆至畢赤酵母真核分泌表達(dá)載體pPIC9K進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Wester