天然雙特異性抗體的產(chǎn)生及其生物學(xué)特性的初步研究.pdf

1、目的：
　　 通過構(gòu)建產(chǎn)生天然雙特異性抗體的新西蘭大白兔動(dòng)物模型，鑒定天然雙特異性抗體的產(chǎn)生。初步探討了天然雙特異性抗體的生物學(xué)特性，及其天然特異性抗體的產(chǎn)生機(jī)制。為臨床靶向治療和自身免疫疾病機(jī)制的探討提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 用過碘酸鈉氧化法將半抗原地高辛(Dig)與載體牛血清白蛋白(BSA)和銅藍(lán)蛋白(KLH)交聯(lián)，制備免疫原。同時(shí)用同樣方法做半抗原和載體蛋白的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記，用于EL

2、ISA免疫分析。
　　 構(gòu)建八組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，每組雌雄各半。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沿脊索多位點(diǎn)皮下免疫乳化的抗原2mg，三個(gè)月后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，計(jì)量減半。二個(gè)月后進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫。二個(gè)月后第三次加強(qiáng)免疫，一周后采血。應(yīng)用雙抗原夾心法測定各組單特異性抗體和雙特異性抗體的產(chǎn)生情況。并應(yīng)用雙抗原夾心抑制法進(jìn)一步堅(jiān)定雙特異性抗體的存在。
　　 以BSA-Dig組為例純化雙特異性抗體一抗BSA和抗Dig。純化方法依次經(jīng)過50％(NH4)SO4沉

3、淀，蛋白A親和層析，BSA-Sepharos4B親和層析和Dig-Sepharose4B親和層析。每次純化后都進(jìn)行單特異性抗體和雙特異性抗體的檢測，以及抗體純度的SDS-PAGE鑒定。最后獲得較純的抗BSA和Dig的雙特異性抗體。同時(shí)會(huì)獲得較純的抗BSA和抗Dig單特異性抗體。
　　 50％(NH4)SO4沉淀后的免疫血清進(jìn)行分子篩，觀察產(chǎn)生峰值的情況。同時(shí)峰進(jìn)行單特異性抗體和雙特異性抗體ELISA分析，SDS-PAGE電泳分析

4、，從而初步鑒定雙特異性抗體亞型。應(yīng)用抗人IgG單克隆抗體亞型IgG1，IgG2，IgG3和IgG4鑒定純化后的雙特異性抗體亞型。
　　 對(duì)于雙特異性抗體產(chǎn)生機(jī)制的初步探討，利用谷胱甘肽作為還原劑進(jìn)行雙特異性抗體體內(nèi)交換實(shí)驗(yàn)，利用Balb/c裸鼠和新西蘭大白兔進(jìn)行雙特異性抗體體外交換實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 Dig與載體BSA的交聯(lián)率約為7.3，Dig與載體BSA的交聯(lián)率約為0，1mmol/mgKLH。Dig，D

5、NP，BSA和KLH與HRP的標(biāo)記最適反應(yīng)濃度分別為1:500，1:200，1:200和1:800。
　　 在載體和半抗原交聯(lián)免疫組都有相應(yīng)雙特異性抗體的存在，而對(duì)照組沒有。同時(shí)雌性比雄性動(dòng)物的滴度高。雙特異性抗體產(chǎn)生的規(guī)律與單特異性抗體產(chǎn)生的規(guī)律相似。
　　 載體和半抗原交聯(lián)免疫免疫組血清經(jīng)過系列純化后獲得較純的雙特異性抗體。免疫血清50％(NH4)SOP4沉淀后的分子篩結(jié)果顯示雙特異性抗體可為IgG和IgM。純化后的

6、雙特異性抗體與抗人IgG單克隆抗體亞型IgG1，IgG2，IgG3和IgG4鑒定后發(fā)現(xiàn)雙特異性抗體無型特異性，主要為IgG2和IgG4。
　　 經(jīng)雙特異性抗體體內(nèi)交換實(shí)驗(yàn)和體外交換實(shí)驗(yàn)證實(shí)雙特異性抗體可以體外和在同類動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生。
　　 結(jié)論：
　　 雙特異性抗體可以在新西蘭大白兔天然產(chǎn)生。雙特異性抗體不僅在交聯(lián)的載體和半抗原之間產(chǎn)生，而且在同時(shí)免疫的交聯(lián)的載體和半抗原對(duì)之間隨機(jī)組合產(chǎn)生。雌性動(dòng)物比雄性動(dòng)物更易產(chǎn)