兒童白血病病人特異性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)樣細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　急性白血病是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的血液系統(tǒng)腫瘤，約占該時(shí)期所有惡性腫瘤的35％。隨著危險(xiǎn)分組治療的開(kāi)展、化療方案的進(jìn)步和支持治療的改善，ALL長(zhǎng)期無(wú)病生存率可達(dá)70％～80％，而AML的長(zhǎng)期無(wú)病生存率可達(dá)50％左右[1-3]。但仍有部分病例早期復(fù)發(fā)或治療失敗，HSCT是該部分患者的最佳選擇。但造血干細(xì)胞移植的成敗與HLA的配型密切相關(guān)，如果HLA不相合，便可能會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的排異反應(yīng)，甚至危及生命。目前國(guó)際上推薦首選H

2、LA匹配相關(guān)供者的HSCT，但由于80％的兒童白血病患者缺少這種供者，auto-HSCT也被選擇性地應(yīng)用于白血病的治療。auto-HSCT的不足之處是白血病的復(fù)發(fā)率高，移植治療后復(fù)發(fā)的原因主要是自體移植物中殘余的白血病細(xì)胞(其中還可能包括極少量的白血病干細(xì)胞)隨著移植物再次輸入人體內(nèi)以及移植后無(wú)移植物抗白血病(GVL)效應(yīng).為此，尋找一種全新的非腫瘤細(xì)胞來(lái)源的自體干細(xì)胞進(jìn)行移植對(duì)于降低移植后白血病復(fù)發(fā)具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用前景。<

3、br>　　iPSCs細(xì)胞具有類似于ESCs的多向分化特性，在特定的誘導(dǎo)條件下既可向造血干/祖細(xì)胞分化，也可向成熟的血細(xì)胞如紅細(xì)胞、單核細(xì)胞和NK細(xì)胞等分化。為此，誘導(dǎo)產(chǎn)生白血病病人特異性的iPSCs或許將對(duì)白血病的治療帶來(lái)新的突破。
　　要成功地誘導(dǎo)產(chǎn)生病人特異性的iPSCs，應(yīng)考慮如下幾個(gè)問(wèn)題：(1)選用合適的載體；(2)選用最適的轉(zhuǎn)錄因子；(3)適合重編程的靶細(xì)胞；(4)選用合適的能維持干細(xì)胞特性和促使干細(xì)胞分化的培養(yǎng)基。

4、r>　　通過(guò)病毒載體導(dǎo)入外源基因進(jìn)行體細(xì)胞重編程獲得iPSCs是目前最為常用的方法。盡管如此，病毒介導(dǎo)的重編程方法由于外源性基因和病毒骨架序列會(huì)永久地整合于靶細(xì)胞基因組內(nèi)，并且轉(zhuǎn)基因的反式激活會(huì)最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生而限制了其臨床應(yīng)用[23]。通過(guò)非病毒的方式或使用非整合的載體導(dǎo)入外源基因?qū)Ⅲw細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs已經(jīng)取得成功[24-27]。盡管如此，體細(xì)胞重編程至今尚無(wú)普適性的載體。
　　鑒于需要導(dǎo)入一定數(shù)量的轉(zhuǎn)錄因子基因后方能有效地

5、進(jìn)行體細(xì)胞重編程，為此，目前有許多關(guān)于不同轉(zhuǎn)錄因子組合進(jìn)行體細(xì)胞重編程的研究。iPSCs最先是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2，Klf4和cMyc或Oct4、Sox2、Lin28和Nanog)誘導(dǎo)產(chǎn)生的[4-6]后來(lái)，導(dǎo)入3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2和Klf4)或2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4和Sox2或Klf4)甚至單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4)即可成功誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSCs亦可見(jiàn)報(bào)道[28-32]，但未見(jiàn)采用單個(gè)Oct4基因?qū)?/p>

6、能獲得人類iPSCs的報(bào)道?？梢?jiàn)Oct4是體細(xì)胞誘導(dǎo)iPSCs所不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子。
　　選擇合適的靶細(xì)胞進(jìn)行重編程是另一個(gè)非常重要的問(wèn)題。這些靶細(xì)胞應(yīng)當(dāng)易于獲得和易于在體外培養(yǎng)增殖。這些細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞、NK細(xì)胞以及來(lái)自于外周血或皮膚的成纖維細(xì)胞、來(lái)自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞以及來(lái)自血管的內(nèi)皮細(xì)胞等。將人臍血來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，ECs)、動(dòng)員的外周血干/祖細(xì)胞以及非動(dòng)員的外周血T淋巴細(xì)胞等重編程

7、誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSCs已有報(bào)道[15-17]。盡管如此，目前有關(guān)將來(lái)源于白血病病人的體細(xì)胞重新編程后獲得iPSCs方面的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道，尤其利用兒童白血病病人體細(xì)胞進(jìn)行重編程研究則未見(jiàn)報(bào)道。MUELLER LP等研究表明從化療后的骨髓標(biāo)本中同樣可分離到足夠數(shù)量且符合臨床應(yīng)用的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesanchymal stem cells，MSCs)[22]。可見(jiàn)，將白血病病人骨髓來(lái)源的MSCs作為誘導(dǎo)產(chǎn)生病人特異性的iPSCs的靶細(xì)胞不無(wú)可能。<

8、br>　　本研究試圖將白血病病兒骨髓來(lái)源的MSCs重編程成為iPSCs，分析其生物學(xué)特性，探索其向CD34+和/或CD45+的細(xì)胞分化的可能性及方法，并盼望通過(guò)該研究能為將來(lái)白血病的個(gè)體化治療提供新的治療方法。
　　本研究主要包括以下三個(gè)部分：(1)iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在白血病細(xì)胞中的表達(dá)、基因的克隆及載體構(gòu)建；(2)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBM-MSCs)的培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性分析；(3)hBM-MSCs來(lái)源的iPSCs樣

9、細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性鑒定。
　　方法:
　　1 iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在白血病細(xì)胞中的表達(dá)、基因的克隆及載體構(gòu)建
　　1.1 iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在白血病細(xì)胞株及白血病細(xì)胞中的表達(dá)譜研究：通過(guò)RT-PCR和Real-Time PCR檢測(cè)9個(gè)白血病細(xì)胞株包括KGla，Meg-01，HL-60，K562，U937，Molt-3，Molt-4，Nalm-6和Raji以及53例白血病標(biāo)本中iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

10、基因(包括Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog)的表達(dá)情況.經(jīng)知情同意將取自9例ITP病人的骨髓標(biāo)本作為對(duì)照。
　　1.2誘導(dǎo)多能干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及序列分析：根據(jù)基因表達(dá)譜研究結(jié)果，設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)的引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增各轉(zhuǎn)錄因子基因的ORF序列，經(jīng)測(cè)序比對(duì)后，將序列克隆至pGEM(R)-T載體。
　　1.3誘導(dǎo)多能干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建：通過(guò)酶切、連接反應(yīng)，將

11、克隆至pGEM(R)-T載體的序列插入至真核表達(dá)載體pcDNA3.1。
　　2入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBM-MSCs)的培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性分析
　　2.1 hBM-MSCs的培養(yǎng)和鑒定：通過(guò)全骨髓培養(yǎng)和密度梯度離心相結(jié)合的方法分離獲得MSCs，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs表面抗原的表達(dá)情況。
　　2.2 hBM-MSCs的類ESCs生物學(xué)特性分析：通過(guò)RT-PCR和Real-Time PCR檢測(cè)檢測(cè)MSCs中iPSCs

12、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光法檢測(cè)MSCs中多能性標(biāo)記物如SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81等的表達(dá)情況。
　　3 hBM-MSCs來(lái)源的iPSCs樣細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性鑒定
　　3.1穩(wěn)定表達(dá)Oct4蛋白的hBM-MSCs細(xì)胞的建株：將真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Oct4轉(zhuǎn)染MSCs，通過(guò)多輪亞克隆篩選出穩(wěn)定表達(dá)Oct4的細(xì)胞株；通過(guò)RT-PCR、Real Time PCR、免疫熒光法

13、、流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測(cè)Oct4的表達(dá)。
　　3.2穩(wěn)定表達(dá)Oct4蛋白的MSCs(MSCs-Oct4)的生物學(xué)特性研究：通過(guò)免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs-Oct4細(xì)胞中ESCs多能性標(biāo)志物的表達(dá)情況；通過(guò)RT-PCR和Real Time PCR檢測(cè)MSCs-Oct4細(xì)胞中Nanog和Sox2基因的表達(dá)。
　　3.3不同轉(zhuǎn)錄因子組合瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染MSCs的轉(zhuǎn)染效率分析：分成4種不同的轉(zhuǎn)錄因子組合(均含定位

14、蛋白GFP)，連續(xù)兩次瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染MSCs，流式檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)ESCs多能性標(biāo)志物的表達(dá)情況；通過(guò)定位蛋白的表達(dá)情況比較不同組合的轉(zhuǎn)染效率。
　　3.4 hBM-MSCs來(lái)源的iPSCs樣細(xì)胞的鑒定及其生物學(xué)特性研究：免疫熒光法，流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測(cè)ESCs多能性標(biāo)志物的表達(dá)情況；通過(guò)堿性磷酸酶染色、端粒酶活性、擬胚體形成和畸胎瘤形成試驗(yàn)鑒定MSCs來(lái)源的iPSCs樣細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　3.5 MSCs

15、來(lái)源的iPSCs樣細(xì)胞向造血系細(xì)胞定向分化：在特定造血生長(zhǎng)因子包括IL-3，IL-6，F(xiàn)lt-3 Ligand，SCF，G-CSF和BMP4的作用下，誘導(dǎo)MSCs來(lái)源的iPSCs樣細(xì)胞向CD34+和/或CD45+的細(xì)胞分化，流式檢測(cè)CD34+和/或CD45+的表達(dá)陽(yáng)性率，RT-PCR檢測(cè)CD34和/或CD45基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1 iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在白血病細(xì)胞中的表達(dá)，基因的克隆及載體構(gòu)建
　　1.

16、1 iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在白血病細(xì)胞中的表達(dá)譜研究：RT-PCR結(jié)果表明，9/9個(gè)細(xì)胞株表達(dá)cMyc和Lin28基因；3/9細(xì)胞株(U937，K562和HL60)表達(dá)Klf4基因；2/9細(xì)胞株(Molt-3和K562)表達(dá)Oct4基因；2/9細(xì)胞株(KG1a和Meg-01)表達(dá)Nanog基因；3/9細(xì)胞株(KG1a、Meg-01和Raji)低水平表達(dá)Sox2基因。53/53例標(biāo)本中檢測(cè)到cMyc基因表達(dá)，16/53例標(biāo)本中檢測(cè)到K

17、lf4表達(dá)，20/53例標(biāo)本中檢測(cè)到Lin28低水平表達(dá)，11/53例標(biāo)本中檢測(cè)到Sox2、低水平表達(dá)，7/53例標(biāo)本中檢測(cè)Oct4極低水平表達(dá)，3/53例標(biāo)本中檢測(cè)到Nanog基因表達(dá)。
　　Real Time PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組(N=9)相比，白血病細(xì)胞株組(N=9)cMyc基因表達(dá)上調(diào)(P=0.012)，而Klf4(P=0.001)和Sox2基因(P=0.010)則表達(dá)下調(diào)，兩組間差異具有顯著意義.而Nanog(P=0

18、.08)、Lin28(P=0.882)和Oct4基因(P=0.456)的表達(dá)兩組間差異無(wú)顯著性。iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因包括cMyc、Klf4、Lin28、Nanog、Oct4和Sox2在白血病細(xì)胞株中的平均相對(duì)表達(dá)量分別為4.63±8.51％、0.45±0.51％、0.014±0.023％、0.004±0.006％、0.083±0.085％和0.45±0.51％。髓系和淋系細(xì)胞株在cMyc(P=0.063)、Klf4(P=0.111

19、)和Sox2(P=0.286)三個(gè)基因的表達(dá)量方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　與對(duì)照組(N=9)相比，白血病組(N=53)cMyc表達(dá)上調(diào)(P=0.001)，而Klf4(P=0.04)則表達(dá)下調(diào)。Sox2(P=0.266)、Nanog(P=0.237)，Lin28(P=0.769)和Oct4基因(P=0.93)的表達(dá)，對(duì)照組和白血病細(xì)胞組間差異無(wú)顯著性。iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因包括cMyc、Klf4、Lin28、Nanog、Oct4和S

20、ox2在白血病細(xì)胞株中的平均相對(duì)表達(dá)量分別為3.49±3.78％、0.83±0.38％、0.33±1.29％、0.83±0.38％、0.009±0.036％和0.83±0.38％。AML(N=26)和ALL(N=27)兩組在cMyc(P=0.803)和Klf4(P=0.098)兩個(gè)基因的表達(dá)量方面也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　1.2 iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及序列分析：分別以KG1a、Nalm-6和Meg-01細(xì)胞cDNA為模板，

21、均可擴(kuò)增出1320bp左右的單一cMyc基因條帶和630bp左右單一Lin28基因條帶，相應(yīng)的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后與理論序列完全吻合；分別以KG1a和Meg-01細(xì)胞eDNA為模板，均可擴(kuò)增出918bp左右的單一Nanog基因條帶，送測(cè)序發(fā)現(xiàn)存在6個(gè)堿基突變，其中3個(gè)無(wú)意突變，3個(gè)有意突變；以U937細(xì)胞cDNA為模板，擴(kuò)增出1413bp左右的單一Klf4基因條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后與理論序列完全吻合；以畸胎瘤eDNA為模板，擴(kuò)增出954

22、bp左右的單一Sox2基因條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后與理論序列完全吻合；分別以肝臟組織和睪丸腫瘤cDNA為模板，均可擴(kuò)增出1083 bp左右的單一Oct4基因條帶，測(cè)序發(fā)現(xiàn)有很多堿基突變.通過(guò)SOE的方法將Nanog基因中的3個(gè)有意突變進(jìn)行了回復(fù)突變。通過(guò)TA克隆系統(tǒng)將上述測(cè)序正確的各轉(zhuǎn)錄因子基因克隆至pGEM(R)-T載體。
　　1.3 iPSCs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因賓核表達(dá)載體的構(gòu)建：通過(guò)酶切、連接反應(yīng)，將克隆至pGEM(R)-T載

23、體的各轉(zhuǎn)錄因子基因插入至真核表達(dá)載體pcDNA3.1。通過(guò)人工合成的方法合成Oct4序列，并將其插入至真核表達(dá)載體pcDNA3.1和peGFP-N1，經(jīng)測(cè)序，插入的各轉(zhuǎn)錄因子基因序列完全正確。
　　2入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBM-MSCs)的培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性分析
　　2.1 hBM-MSCs的培養(yǎng)和鑒定：流式結(jié)果表明，第10代之前的hBM-MSCs均強(qiáng)表達(dá)CD29，CD105，CD166和CD44，共檢測(cè)3次，平均陽(yáng)性率

24、分別為95.89±2.20％，97.40±1.56％，96.94±1.45％和95.67±0.89％；第5代之前的hBM-MSCs均較強(qiáng)表達(dá)CD90，平均陽(yáng)性率為93.88±5.08％，P5代后的hBM-MSCs弱表達(dá)CD90，hBM-MSCs不表達(dá)CD34，CD38，CD14，CD19和HLA-DR，其平均陽(yáng)性率均<5％。
　　2.2 hBM-MSCs的類ESCs生物學(xué)特性分析：PCR結(jié)果顯示，MSCs僅內(nèi)源性表達(dá)Sox2基因；

25、免疫熒光和流式結(jié)果顯示內(nèi)源性表達(dá)Sox2，其表達(dá)平均陽(yáng)性率為16.70％。極低表達(dá)ESCs其它的多能標(biāo)志物Oct4、Nanog、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81(其平均陽(yáng)性率不到5％)。
　　3 hBM-MSCs來(lái)源的iPSCs樣細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性鑒定
　　3.1穩(wěn)定表達(dá)Oct4蛋白的hBM-MSCs細(xì)胞(MSCs-Oct4)的建株：3輪亞克隆后Oct4的表達(dá)陽(yáng)性率分別為49.99％、70.75％和94

26、.66％，而對(duì)照組MSCs其Oct4的表達(dá)陽(yáng)性率為1.72％；免疫熒光顯示胞核內(nèi)Oct4的表達(dá)，Western Blot顯示MSCs-Oct4細(xì)胞存在大小約為45kDa的蛋白條帶。Real-Time PCR結(jié)果顯示，MSCs-Oct4細(xì)胞(轉(zhuǎn)染68d后)內(nèi)源性O(shè)ct4和總Oct4基因的相對(duì)mRNA表達(dá)量分別是未轉(zhuǎn)染MSCs細(xì)胞的6.23和7.20倍。
　　3.2 MSCs-Oct4的生物學(xué)特性研究：流式結(jié)果顯示，MSCs-Oct4

27、細(xì)胞其Nanog和Sox2的平均表達(dá)水平分別從未轉(zhuǎn)染時(shí)的0.61％和12.33％增加至40.61％和96.21％；SSEA-4，TRA-1-60及TRA-1-81的表達(dá)陽(yáng)性率分別從未轉(zhuǎn)染時(shí)的8.21％、1.72％和2.53％增加至90.77％、64.62％和71.70％。Real-Time PCR結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染的MSCs細(xì)胞相比較，hBM-MSCs-Oct4細(xì)胞其Nanog和Sox2的相對(duì)mRNA表達(dá)量分別增加了8.68和2.13倍

28、；免疫熒光顯示胞核內(nèi)Nanog和Sox2的表達(dá)。
　　3.3不同轉(zhuǎn)錄因子組合瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染MSCs的轉(zhuǎn)染效率分析：隨著轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目的增加，轉(zhuǎn)染效率逐漸下降；僅轉(zhuǎn)染一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(1TF)時(shí)綠色熒光最強(qiáng)，6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(6TF)共轉(zhuǎn)染時(shí)熒光最弱。6TF、5TF、3TF和1TF瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染hBM-MSCs時(shí)多能性標(biāo)志物SSEA-4的表達(dá)陽(yáng)性率分別為86.10％、74.16％、75.79％和89.41％；TRA-1-60的表達(dá)陽(yáng)性率分別為32.6

29、6％、33.20％、38.55％和42.77％；TRA-1-81的表達(dá)陽(yáng)性率分別為17.24％、39.25％、34.07％和64.97％。
　　3.4 hBM-MSCs來(lái)源的iPSCs樣細(xì)胞的鑒定及其生物學(xué)特性研究：MSCs來(lái)源的iPSCs樣細(xì)胞邊界清晰，核質(zhì)比高，堿性磷酸酶染色和端粒酶活性檢測(cè)均陽(yáng)性；體外培養(yǎng)時(shí)可形成擬胚體，表達(dá)三個(gè)胚層的基因SPARC、Brachyury、TBX20、TUBB3和WNT1；分化第21天時(shí)多能性標(biāo)

30、志物SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81表達(dá)陽(yáng)性率分別從90.77％、64.62％和71.70％降至4.25％、3.07％和1.69％。MSCs來(lái)源的iPSCs在裸鼠體內(nèi)能產(chǎn)瘤，瘤體切片HE染色顯示為未分化的干細(xì)胞。
　　3.5 MSCs來(lái)源的iPSCs樣細(xì)胞向造血系細(xì)胞定向分化：MSCs來(lái)源的iPSCs樣細(xì)胞在造血生長(zhǎng)因子包括IL-3，IL-6，F(xiàn)lt-3 Ligand，SCF，G-CSF和BMP4的作用下，能向CD

31、34+和CD45+的細(xì)胞分化，分化培養(yǎng)第20天其表達(dá)陽(yáng)性率分別為26.22％和26.03％；RT-PCR檢測(cè)到CD34和CD45的基因條帶；甲基纖維素半固體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)14時(shí)觀察到CFU-GM樣的集落形成。
　　結(jié)論:
　　1、成功地將兒童白血病骨髓MSCs誘導(dǎo)成為具有多能性的iPSCs樣細(xì)胞；
　　2、單個(gè)Oct4轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染MSCs能有效上調(diào)Nanog和Sox2的表達(dá)，并能誘導(dǎo)人iPSCs樣細(xì)胞的產(chǎn)生；