A型血友病人非整合誘導(dǎo)多能干細(xì)胞建系及其細(xì)胞疾病模型的建立.pdf

1、背景與目的:
　　 A型血友病（hemophilia A，HA）是一種由于凝血因子Ⅷ(coagulation factor Ⅷ，F(xiàn)Ⅷ)基因缺陷所致的嚴(yán)重的出血性疾病，是臨床上最常見的X連鎖隱性遺傳病，在男性中的發(fā)病率約為1/5000。主要臨床表現(xiàn)是自幼反復(fù)發(fā)生異常出血，出血部位為關(guān)節(jié)、肌肉、皮膚、粘膜和軟組織，上消化道及泌尿系統(tǒng)出血也較常見，重型患者（FⅧ因子活性＜1％）可因內(nèi)臟及顱內(nèi)出血而危及生命。FⅧ基因的致病突變分散在所有

2、外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子序列上，內(nèi)含子22倒位是FⅧ基因最常見的突變類型，導(dǎo)致約45～50％重型HA，占所有HA患者的20％;另一常見突變內(nèi)含子1倒位導(dǎo)致約5％的重型HA;其余有點(diǎn)突變、大片段缺失、小片段缺失、插入等。
　　 目前血友病的治療主要是因子替代治療，基因治療和細(xì)胞移植治療是未來的治療方向。因子替代治療是目前HA臨床治療中首選方案，但是替代治療需要定期反復(fù)輸注FⅧ，花費(fèi)巨大，8％～25％的患者在治療過程中產(chǎn)生FⅧ抑制物使治

3、療無效。血友病被認(rèn)為是最適合基因治療的疾病之一，血漿中FⅧ濃度只要達(dá)到正常濃度的1％～5％就能起到明顯的治療效果，人FⅧ的表達(dá)不局限于某一特定的靶細(xì)胞，許多細(xì)胞都能產(chǎn)生有生物活性的FⅧ，并能分泌至血液中?；蛑委煹哪繕?biāo)是將正常的FⅧ基因?qū)胙巡患者體內(nèi)，糾正FⅧ基因缺陷，從而使患者體內(nèi)產(chǎn)生具有正常功能的人FⅧ蛋白。目前僅有極少數(shù)研究報道血友病基因治療的臨床Ⅰ期試驗(yàn)成功，現(xiàn)有基因治療失敗最主要的原因是宿主免疫反應(yīng)使外源野生型基因表達(dá)水

4、平逐漸減低甚至消失，另外載體插入突變可能使基因治療患者發(fā)生腫瘤。細(xì)胞移植治療是指利用健康的細(xì)胞來修復(fù)或取代損傷的組織，但移植細(xì)胞來源、免疫排斥等是很難解決的問題。
　　 動物實(shí)驗(yàn)是血友病機(jī)制、治療研究中不可缺少的環(huán)節(jié)。自然中存在的血友病模型有犬模型，人工基因剔除血友病動物模型有小鼠、羊、靈長類等種類。人類與動物在生理、生化、解剖結(jié)構(gòu)上有著巨大差異，種屬間的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率、基因表達(dá)、蛋白修飾加工和免疫反應(yīng)均存在差別，在動物模型上篩選有

5、效的藥物或治療方法在人體上可能無效，動物研究尚不能完全預(yù)測臨床結(jié)果，應(yīng)當(dāng)通過其它種類疾病模型的實(shí)驗(yàn)方案來驗(yàn)證動物實(shí)驗(yàn)的有效性。
　　 2006年誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)技術(shù)誕生了。由體細(xì)胞重編程得到的iPSCs與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)有相同的特征:具有自我更新和分化為身體各種組織與器官的潛能，都屬于多能性干細(xì)胞。iPSCs

6、不受細(xì)胞來源、免疫排斥、倫理、宗教和法律等諸多方面的限制。利用iPSCs誘導(dǎo)技術(shù)可以將患者體細(xì)胞重編程成為患者特異性iPSCs，作為疾病的細(xì)胞模型來開展發(fā)病機(jī)制、藥物篩選、毒理等研究工作?；颊邅碓吹膇PSCs能夠產(chǎn)生病人特異性的供體細(xì)胞用于細(xì)胞移植和組織替代治療，沒有倫理及免疫排斥等問題，從而最終實(shí)現(xiàn)個體化自體細(xì)胞移植治療，這是現(xiàn)有細(xì)胞移植治療或基因治療所不能比擬的優(yōu)勢。2009年，Xu D等將鼠尾尖部皮膚的成纖維細(xì)胞重編程成iPSCs

7、，然后定向分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。再將這些分化出來的內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞直接注射到用射線處理過的血友病A模型鼠的肝臟，通過尾部出血分析發(fā)現(xiàn)，未處理組的血友病A模型鼠幾個小時全部死亡，處理組的血友病A模型鼠存活在3個月以上，小鼠血漿中凝血因子Ⅷ的活性較對照組升高8％～12％，出血癥狀得到了很大的改善。這是首個關(guān)于iPSCs治療血友病的研究，展現(xiàn)了iPSCs在血友病治療上的應(yīng)用前景，為HA的研究提供了新的契機(jī)。
　　 迄今為止，

8、人血友病iPSCs的相關(guān)研究還是空白，建立不同人FⅧ基因突變類型的iPSCs細(xì)胞庫可以為深入研究HA疾病提供一個新的平臺，為今后的臨床應(yīng)用提供最基本條件。本研究以HA病人中最常見的FⅧ基因突變類型IVS22倒位為研究對象，建立了15株HA iPSCs細(xì)胞系，對其中兩株進(jìn)行了全面的鑒定;同時將HA iPSCs定向分化為肝細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上建立了HA的細(xì)胞疾病模型，為今后HA的疾病機(jī)制研究、藥物篩選及細(xì)胞移植治療奠定研究基礎(chǔ)。
　　

9、 方法:
　　 1.A型血友病人非整合iPSCs的建立與鑒定
　　 收集A型血友病重型病人的尿液標(biāo)本，分離及培養(yǎng)尿細(xì)胞。利用oriP/EBNA1附加體( episome)載體過表達(dá)人OCT4、SOX2、KLF4三個轉(zhuǎn)錄因子以及SV40LT基因，將病人尿細(xì)胞重編程為iPSCs，同時利用小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)302-367簇提高重編程效率。在誘導(dǎo)過程中，采用無血清、無滋養(yǎng)層細(xì)胞的方式進(jìn)行誘導(dǎo)，避免誘導(dǎo)

10、過程中的動物成分的污染給將來的應(yīng)用帶來潛在的危害。
　　 在獲得HA iPSCs克隆后，需要做多方面的綜合鑒定判斷該克隆是否真正獲得了多能性狀態(tài)。通過免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)鑒定人胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。RT-PCR檢測內(nèi)源多能性基因的表達(dá)及外源基因是否沉默。PCR檢測外源多能性基因或外源載體片段是否整合進(jìn)入iPS細(xì)胞基因組中。通過重硫酸鹽測序分析，比較多能性基因(NANOG及OCT4)啟動子區(qū)甲基化程度的改變。應(yīng)用長距離PCR對H

11、A尿細(xì)胞和HA iPSCs的基因組DNA進(jìn)行FⅧ基因內(nèi)含子22倒位的檢測，確認(rèn)HA的突變類型。核型分析鑒定HA iPSCs的核型是否正常。微衛(wèi)星鑒定確認(rèn)HA iPSCs的親本來源及排除實(shí)驗(yàn)室ESCs的污染。擬胚體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HAiPSCs體外分化潛能?；ネ磳?shí)驗(yàn)驗(yàn)證HA iPSCs體內(nèi)分化潛能。
　　 2.A型血友病人iPSCs體外定向肝分化
　　 將HA iPSCs定向分化為肝細(xì)胞分為4個階段:確定內(nèi)胚層（definiti

12、veendoderm，DE）定向，肝前體定向，肝前體擴(kuò)增和肝細(xì)胞成熟。在單層和無血清的培養(yǎng)條件下，分4個階段序貫加入激活素A(Activin A);成纖維細(xì)胞生長因子4(fibroblast growth factor4，F(xiàn)GF4)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic proteins2，BMP2）;肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和角質(zhì)化細(xì)胞生長因子(kerationcyt

13、e growth factor，KGF);制瘤素（oncostatin M，OSM）和糖皮質(zhì)激素( glucoconicoid)，促使HA iPSCs誘導(dǎo)分化為成熟的肝細(xì)胞。應(yīng)用免疫熒光鑒定肝細(xì)胞分化各個階段的特異性蛋白表達(dá)，PAS糖原染色分析鑒定HA iPSCs來源的肝細(xì)胞是否具備合成和儲存糖原的能力。
　　 3.A型血友病細(xì)胞模型的疾病表型鑒定
　　 在HA iPSCs分化的肝細(xì)胞的基礎(chǔ)上，從轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平、功能

14、水平觀察血友病A疾病表型。應(yīng)用熒光定量PCR檢測分化肝細(xì)胞FⅧ基因mRNA的表達(dá)。免疫熒光鑒定分化肝細(xì)胞FⅧ蛋白的表達(dá)。FⅧ活性測定鑒定分化肝細(xì)胞表達(dá)的FⅧ蛋白的凝血功能。
　　 結(jié)果:
　　 1.A型血友病人非整合iPSCs的建立與鑒定
　　 共建立了15株HA iPSCs細(xì)胞系，對其中兩株進(jìn)行了全面鑒定。HA iPSCs具有典型的ESCs克隆的形態(tài):克隆致密、細(xì)胞核大、高核質(zhì)比。HA iPSCs呈現(xiàn)堿性磷酸酶

15、陽性，表達(dá)人胚胎干細(xì)胞核抗原NANOG、OCT4及人胚胎干細(xì)胞特異的表面標(biāo)記SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。其外源基因表達(dá)沉默，內(nèi)源多能性基因表達(dá)，基因組DNA無外源基因及載體序列的整合。與HA尿細(xì)胞相比，HA iPSCs的NANOG和OCT4啟動子區(qū)發(fā)生了顯著的去甲基化。HA iPSCs FⅧ基因突變類型為內(nèi)含子22倒位。HA iPSCs核型正常，其來源于HA尿細(xì)胞并且無ESCs的污染。擬胚體和畸胎瘤實(shí)

16、驗(yàn)證明，HA iPSCs具有分化為三個胚層的能力。
　　 2.A型血友病人iPSCs體外定向肝分化
　　 HA iPSCs誘導(dǎo)分化的成熟肝細(xì)胞呈現(xiàn)類似于肝上皮細(xì)胞的多邊形形態(tài)，細(xì)胞核清晰，胞質(zhì)內(nèi)顆粒豐富。免疫熒光結(jié)果顯示HA iPSCs在肝分化過程中不同階段表達(dá)相應(yīng)的分子標(biāo)志:確定內(nèi)胚層階段表達(dá)SOX17和FOXA2，肝細(xì)胞前體階段表達(dá)HNF4α和AFP，肝細(xì)胞成熟階段表達(dá)A1AT和ALB。分化成熟的肝細(xì)胞PAS糖原染色

17、陽性，反映其具備合成和儲存糖原的能力。
　　 3.基于iPS技術(shù)的A型血友病細(xì)胞疾病模型的建立
　　 與無FⅧ缺陷的正常對照組相比，F(xiàn)Ⅷ基因內(nèi)含子22倒位的HA iPSCs體外定向分化得到的肝細(xì)胞不能正常轉(zhuǎn)錄FⅧ基因mRNA，不能表達(dá)正常的FⅧ蛋白。HA iPSCs分化肝細(xì)胞的培養(yǎng)上清及細(xì)胞裂解液中FⅧ活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常iPSCs及ESCs誘導(dǎo)的肝細(xì)胞。上述結(jié)果表明，基于iPS技術(shù)的A型血友病細(xì)胞疾病模型成功建立。

18、　　 結(jié)論:
　　 1.采用episome系統(tǒng)，以無血清、無滋養(yǎng)層細(xì)胞的誘導(dǎo)方式能將FⅧ基因IVS22倒位的HA病人的尿細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，從而建立了非病毒的、無外源DNA整合的、安全的、HA病人特異性的iPS細(xì)胞系。
　　 2.在無血清單層培養(yǎng)的條件下，模擬體內(nèi)肝臟的發(fā)育過程，不同時間點(diǎn)添加不同生長因子組合，能將HA iPSCs定向分化為肝細(xì)胞。這為解決HA肝細(xì)胞來源提供了新途徑，為肝細(xì)胞藥物篩選和肝細(xì)胞移植治療