重型α-地中海貧血胎兒羊水來源的誘導多能干細胞系的建立及鑒定.pdf

1、α-地中海貧血（α-地貧）是一組由于α-珠蛋白基因缺失或突變使α-珠蛋白鏈合成不足或缺乏而引起的遺傳性溶血性貧血，是人類最常見的單基因疾病之一。臨床上將α-地中海貧血分為靜止型攜帶者、α-地中海貧血特性、HbH病和血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征。血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征又稱重型α-地中海貧血，主要由于缺少4個α-基因引起。因α-珠蛋白鏈合成完全缺乏，從而導致胎兒嚴重貧血。若不進行宮內治療，胎兒多在孕晚期死亡或出生后數(shù)小時死

2、亡。重型α-地中海貧血是一個重要的全球性健康問題。
　　誘導多能干細胞（iPSCs）是可以通過在已分化的體細胞中同時表達在胚胎干細胞（ESC）中通常以高水平表達的幾種轉錄因子而產生的一種多能干細胞。該干細胞與胚胎干細胞相似，具有自我更新和向三個胚層分化的能力。因此，誘導多能干細胞的產生可以避免使用胚胎干細胞帶來的倫理問題，同時建立個體化疾病特異性iPSCs來治療遺傳性和退行性疾病可以避免免疫排斥的風險。
　　一、目的：

3、>　　建立羊水細胞來源、無外源基因整合的血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征患兒特異性誘導多能干細胞，為基因治療研究及實現(xiàn)個性化宮內治療提供模型。
　　二、方法：
　　1、獲得知情同意后，胎兒被診斷為血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征（--SEA/--SEA）的孕婦于孕16+周在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產前診斷中心行超聲引導下的羊膜腔穿刺術，抽取10毫升羊水用于本研究。
　　2、利用非整合型仙臺病毒介導Klf4、Oct3/

4、4、Sox2及c-Myc4種轉錄因子將血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征胎兒的羊水細胞重編程為誘導多能干細胞。標記為h-AF-SeV-iPSCs。
　　3、通過堿性磷酸酶試驗，免疫熒光標記等對h-AF-SeV-iPSCs進行多能性鑒定。通過擬胚體形成和自發(fā)分化實驗、畸胎瘤形成實驗對h-AF-SeV-iPSCs在體外及體內向3個胚層細胞分化的能力進行鑒定。
　　4、將h-AF-SeV-iPSCs第10代及第20代的細胞進行G顯

5、帶染色體核型分析，檢測細胞經重編程及傳代培養(yǎng)后遺傳物質的穩(wěn)定性。將h-AF-SeV-iPSCs及原代羊水細胞提取DNA,進行缺失型α-地貧基因檢測，對突變基因型進行驗證，同時排除細胞污染。
　　5、6×104個仙臺病毒轉導后的羊水細胞接種在飼養(yǎng)層細胞上，觀察出現(xiàn)克隆的時間，并計算ES樣克?。▔A性磷酸酶染色陽性）的個數(shù)。
　　三、結果：
　　1、成功將血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征胎兒的羊水細胞利用仙臺病毒重編程為非

6、整合型誘導性多能干細胞（h-AF-SeV-iPSCs）。
　　2、h-AF-SeV-iPSCs堿性磷酸酶染色（AP）強陽性。免疫熒光染色提示h-AF-SeV-iPSCs表達胚胎干細胞特異性蛋白Oct4、Sox2、SSEA-4和Tra-1-81。
　　3、將h-AF-SeV-iPSCs注射到7周齡SPF級NOD/SCID雄性小鼠腹股溝皮下，iPS細胞注射10周后摘除腫塊，并進行固定、包埋、切片、HE染色及免疫組化染色， HE染

7、色和免疫組化染色結果均提示畸胎瘤內含有內胚層、中胚層及外胚層組織。h-AF-SeV-iPSCs懸浮培養(yǎng)后可形成囊性擬胚體，貼壁培養(yǎng)后同樣能向三個胚層分化。
　　4、h-AF-SeV-iPSCs第10代及第20代的細胞G顯帶染色體核型分析提示均為正常核型(46，XY)。h-AF-SeV-iPSCs及其原代羊水細胞提DNA行Gap-PCR檢查提示其地中海貧血基因型均為--SEA/--SEA。
　　5、仙臺病毒轉導后第4天，羊水細

8、胞中出現(xiàn)胚胎干細胞樣的克隆。轉導后第7天，將羊水細胞接種到飼養(yǎng)層細胞上，轉導后第9天，可見克隆樣生長的細胞。共出現(xiàn)ES樣克隆30個，堿性磷酸酶染色均陽性，其轉導效率大約為0.05％。
　　四、結論：
　　1、血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征胎兒的羊水細胞在體外可被仙臺病毒誘導為無外源基因整合的iPSCs。
　　2、h-AF-SeV-iPSCs具有自我更新和向三個胚層分化的能力，且羊水細胞經過重編程及在體外長期傳代培養(yǎng)