重型α-地中海貧血胎兒羊水來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系的建立及鑒定.pdf

1、α-地中海貧血（α-地貧）是一組由于α-珠蛋白基因缺失或突變使α-珠蛋白鏈合成不足或缺乏而引起的遺傳性溶血性貧血，是人類最常見(jiàn)的單基因疾病之一。臨床上將α-地中海貧血分為靜止型攜帶者、α-地中海貧血特性、HbH病和血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征。血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征又稱重型α-地中海貧血，主要由于缺少4個(gè)α-基因引起。因α-珠蛋白鏈合成完全缺乏，從而導(dǎo)致胎兒嚴(yán)重貧血。若不進(jìn)行宮內(nèi)治療，胎兒多在孕晚期死亡或出生后數(shù)小時(shí)死

2、亡。重型α-地中海貧血是一個(gè)重要的全球性健康問(wèn)題。
　　誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）是可以通過(guò)在已分化的體細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)在胚胎干細(xì)胞（ESC）中通常以高水平表達(dá)的幾種轉(zhuǎn)錄因子而產(chǎn)生的一種多能干細(xì)胞。該干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞相似，具有自我更新和向三個(gè)胚層分化的能力。因此，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的產(chǎn)生可以避免使用胚胎干細(xì)胞帶來(lái)的倫理問(wèn)題，同時(shí)建立個(gè)體化疾病特異性iPSCs來(lái)治療遺傳性和退行性疾病可以避免免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。
　　一、目的：

3、>　　建立羊水細(xì)胞來(lái)源、無(wú)外源基因整合的血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征患兒特異性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，為基因治療研究及實(shí)現(xiàn)個(gè)性化宮內(nèi)治療提供模型。
　　二、方法：
　　1、獲得知情同意后，胎兒被診斷為血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征（--SEA/--SEA）的孕婦于孕16+周在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心行超聲引導(dǎo)下的羊膜腔穿刺術(shù)，抽取10毫升羊水用于本研究。
　　2、利用非整合型仙臺(tái)病毒介導(dǎo)Klf4、Oct3/

4、4、Sox2及c-Myc4種轉(zhuǎn)錄因子將血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征胎兒的羊水細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。標(biāo)記為h-AF-SeV-iPSCs。
　　3、通過(guò)堿性磷酸酶試驗(yàn)，免疫熒光標(biāo)記等對(duì)h-AF-SeV-iPSCs進(jìn)行多能性鑒定。通過(guò)擬胚體形成和自發(fā)分化實(shí)驗(yàn)、畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)對(duì)h-AF-SeV-iPSCs在體外及體內(nèi)向3個(gè)胚層細(xì)胞分化的能力進(jìn)行鑒定。
　　4、將h-AF-SeV-iPSCs第10代及第20代的細(xì)胞進(jìn)行G顯

5、帶染色體核型分析，檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)重編程及傳代培養(yǎng)后遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。將h-AF-SeV-iPSCs及原代羊水細(xì)胞提取DNA,進(jìn)行缺失型α-地貧基因檢測(cè)，對(duì)突變基因型進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)排除細(xì)胞污染。
　　5、6×104個(gè)仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的羊水細(xì)胞接種在飼養(yǎng)層細(xì)胞上，觀察出現(xiàn)克隆的時(shí)間，并計(jì)算ES樣克?。▔A性磷酸酶染色陽(yáng)性）的個(gè)數(shù)。
　　三、結(jié)果：
　　1、成功將血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征胎兒的羊水細(xì)胞利用仙臺(tái)病毒重編程為非

6、整合型誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（h-AF-SeV-iPSCs）。
　　2、h-AF-SeV-iPSCs堿性磷酸酶染色（AP）強(qiáng)陽(yáng)性。免疫熒光染色提示h-AF-SeV-iPSCs表達(dá)胚胎干細(xì)胞特異性蛋白Oct4、Sox2、SSEA-4和Tra-1-81。
　　3、將h-AF-SeV-iPSCs注射到7周齡SPF級(jí)NOD/SCID雄性小鼠腹股溝皮下，iPS細(xì)胞注射10周后摘除腫塊，并進(jìn)行固定、包埋、切片、HE染色及免疫組化染色， HE染

7、色和免疫組化染色結(jié)果均提示畸胎瘤內(nèi)含有內(nèi)胚層、中胚層及外胚層組織。h-AF-SeV-iPSCs懸浮培養(yǎng)后可形成囊性擬胚體，貼壁培養(yǎng)后同樣能向三個(gè)胚層分化。
　　4、h-AF-SeV-iPSCs第10代及第20代的細(xì)胞G顯帶染色體核型分析提示均為正常核型(46，XY)。h-AF-SeV-iPSCs及其原代羊水細(xì)胞提DNA行Gap-PCR檢查提示其地中海貧血基因型均為--SEA/--SEA。
　　5、仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后第4天，羊水細(xì)

8、胞中出現(xiàn)胚胎干細(xì)胞樣的克隆。轉(zhuǎn)導(dǎo)后第7天，將羊水細(xì)胞接種到飼養(yǎng)層細(xì)胞上，轉(zhuǎn)導(dǎo)后第9天，可見(jiàn)克隆樣生長(zhǎng)的細(xì)胞。共出現(xiàn)ES樣克隆30個(gè)，堿性磷酸酶染色均陽(yáng)性，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率大約為0.05％。
　　四、結(jié)論：
　　1、血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征胎兒的羊水細(xì)胞在體外可被仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)為無(wú)外源基因整合的iPSCs。
　　2、h-AF-SeV-iPSCs具有自我更新和向三個(gè)胚層分化的能力，且羊水細(xì)胞經(jīng)過(guò)重編程及在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)