重型β-地中海貧血患兒異基因造血干細(xì)胞移植后的免疫恢復(fù).pdf

1、研究背景：
　　 異基因造血干細(xì)胞移植(allogenic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)仍然是治愈遺傳性血紅蛋白病如重型β地中海貧血(Thalassemia Major，TM)患兒的唯一手段，但其臨床應(yīng)用受到以下因素的限制，如預(yù)處理的相關(guān)毒性，供者細(xì)胞對(duì)受者細(xì)胞抗原的免疫反應(yīng)引起的移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)

2、及延遲的免疫重建或免疫缺陷導(dǎo)致感染，復(fù)發(fā)及偶爾的排斥等等。造血干細(xì)胞移植后的免疫重建在成人已有較為深入的研究，但對(duì)于兒童研究很少。經(jīng)過(guò)大劑量的化療后，受者免疫細(xì)胞的大量減少，但受者漿細(xì)胞往往可能持續(xù)存在至移植后數(shù)月到數(shù)年。移植前許多因素也可影響移植后的免疫狀態(tài)及其恢復(fù)，如年齡，干細(xì)胞來(lái)源，組織相容性抗原(histocompatibility antigen，HLA)相合的程度等等。移植后的急性GVHD，巨細(xì)胞病毒感染(cytomegal

3、ovirus，CMV)，免疫抑制劑應(yīng)用、抗菌素，免疫球蛋白的應(yīng)用及供者的淋巴細(xì)胞輸注(donor lymphocyte infusions，DLI)等均可影響移植后免疫的恢復(fù)。提高移植后的免疫重建是決定其臨床治療效果的重要因素。我們研究在TM的兒童在清髓性的allo-HSCT后2年內(nèi)的T細(xì)胞亞群及體液免疫的恢復(fù)及其相關(guān)影響因素。
　　 研究目的：
　　 本課題旨在探討TM兒童在異基因外周血造血干細(xì)胞移植后2年內(nèi)的免疫恢復(fù)

4、情況，評(píng)估CMV感染對(duì)T細(xì)胞亞群的影響，評(píng)估不同的供者年齡和受者年齡對(duì)體液免疫的恢復(fù)的影響，從而評(píng)估免疫細(xì)胞在造血干細(xì)胞移植中可能的作用，期望通過(guò)該研究為移植后免疫重建的快速恢復(fù)，減少移植后感染死亡提供指導(dǎo)意義。
　　 方法：
　　 我們回顧性的分析在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院兒科層流病房進(jìn)行外周血造血干細(xì)胞移植的地貧患兒免疫恢復(fù)情況。
　　 第一部分：移植后T細(xì)胞亞群的研究對(duì)象和方法
　　 第一節(jié):移植后半年

5、的T細(xì)胞亞群的研究對(duì)象和方法
　　 1.1)對(duì)于半年內(nèi)的T細(xì)胞亞群的研究對(duì)象，入選研究范圍的標(biāo)準(zhǔn)是:2009年3月至2011年6月內(nèi)所有在我中心的地中海貧血患兒行非親緣外周血造血干細(xì)胞移植的對(duì)象，在移植后半年的隨訪(fǎng)期間內(nèi)未發(fā)生死亡或排斥，半年時(shí)完成T細(xì)胞亞群8項(xiàng)（包括CD3+、CD4+、CD8+、NK、CD4+CD45RA+、CD4+CD29+、CD8+CD28+、CD8+CD28-這八項(xiàng)）和血常規(guī)的評(píng)估，移植后截止于2012年

6、1月仍無(wú)病存活的病例。共有40例患兒，其中CMV感染有20例。評(píng)估其免疫恢復(fù)情況和CMV對(duì)其的影響。
　　 1.2)預(yù)處理方案
　　 患兒均給予清髓性的預(yù)處理方案，包括環(huán)磷酰胺（cyclosphosphamide，Cy）100-120mg/kg，d-10至d-9分兩天靜脈滴注，氟達(dá)拉濱(fludarabine，F(xiàn)lu)，200mg/m2，-6至-2天分5天靜脈滴注，塞替哌(thiotepa，TT)，10mg/kg，-5天

7、1天分兩次靜脈滴注，白消安(buslfan，BU)，9.6-17.6mg/kg，分3-4天靜脈注射(-8至-6天)。所有患兒給予環(huán)孢素A(cyclosporineA)，霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)和ATG（-3--1天）預(yù)防GVHD。短療程的甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)在移植后第1，3，6天分別給予15，10and10mg/m2治療。肝素鈉預(yù)防肝靜脈阻塞綜合癥(hepatic veno-

8、occlusive disease，VOD)。
　　 1.3)移植前及移植后檢測(cè)及預(yù)防巨細(xì)胞病毒定量
　　 移植前常規(guī)進(jìn)行更昔洛韋(10mg/kg)治療，療程8-10天。在allo-HSCT后中性粒細(xì)胞數(shù)＞0.5×109/L開(kāi)始每周監(jiān)測(cè)CMV-DNA復(fù)制數(shù)，直到100天，移植后1月開(kāi)始，常規(guī)進(jìn)行每月7天的或每2月10天的預(yù)防性更昔洛韋治療。CMV感染定義為在外周血中可監(jiān)測(cè)到病毒的復(fù)制數(shù)，即＞500/ul。更昔洛韋的劑量或

9、改用磷甲酸鈉會(huì)依據(jù)患兒的腎功能和外周血中性粒細(xì)胞數(shù)進(jìn)行調(diào)整，如外周血中性粒細(xì)胞數(shù)連續(xù)2天小于0.5×109/L停止更昔洛韋。
　　 1.4)植入的標(biāo)準(zhǔn):移植后28天，第二個(gè)月，適當(dāng)時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)植入證據(jù)。
　　 間接指標(biāo):移植后臨床存活21天;各系統(tǒng)造血恢復(fù)正常，包括紅系，粒系，淋巴系，巨核系等，中性粒細(xì)胞數(shù)在0.5×109/L，血小板數(shù)維持在20×109/L;臨床上出現(xiàn)GVHD。腫大的肝脾回縮至正常大小;乳酸脫氫

10、酶降至正常水平。
　　 直接指標(biāo):供受者性別不同采用免疫熒光原位雜交法(fluorescence in situhybridization，F(xiàn)ISH)檢測(cè)性染色體的轉(zhuǎn)變，供受者性別相同采用短串聯(lián)重復(fù)序列(variable number of tandem repeat，VNTR)（HLA抗原轉(zhuǎn)變成供者型，或供者基因占受者的比例）。
　　 1.5)統(tǒng)計(jì)分析
　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，移植后巨細(xì)胞病

11、毒感染與否與半年內(nèi)的T細(xì)胞亞群的恢復(fù)的影響。先采用單個(gè)樣本T檢驗(yàn)對(duì)各個(gè)T細(xì)胞亞群數(shù)量與設(shè)定的參考值進(jìn)行比較，然后將患兒按有無(wú)CMV感染分組，采用獨(dú)立two-samplestTest檢驗(yàn)方法比較。組間的基礎(chǔ)指標(biāo)的分類(lèi)變量采用卡方比較，等級(jí)資料可采用獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney），定量變量采用2個(gè)樣本的t檢驗(yàn)比較。采用線(xiàn)性相關(guān)分析分析T細(xì)胞亞群CD8+細(xì)胞之間的相關(guān)性。P值小于0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第二節(jié)

12、：移植后1年的T細(xì)胞亞群的研究對(duì)象和方法
　　 對(duì)于1年內(nèi)的T細(xì)胞亞群的研究對(duì)象，入選研究范圍的標(biāo)準(zhǔn)是:2009年3月至2011年1月內(nèi)在我中心的地中海貧血患兒行非親緣外周血造血干細(xì)胞移植的對(duì)象，在移植后1年以上的隨訪(fǎng)期間內(nèi)未發(fā)生死亡或排斥，移植后截止于2012年1月仍無(wú)病存活的病例，移植后1年完成T細(xì)胞亞群4項(xiàng)（至少包括CD3+、CD4+、CD8+、NK這四項(xiàng)）及血常規(guī)的評(píng)估。病人共有38例。對(duì)其病毒的檢測(cè)與植入檢測(cè)同上。應(yīng)用

13、SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單個(gè)樣本t檢驗(yàn)對(duì)各個(gè)T細(xì)胞亞群數(shù)量與設(shè)定的參考值進(jìn)行比較。P值小于0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第二部分：移植后體液免疫的研究對(duì)象和方法
　　 第一節(jié)：移植后半年的體液免疫的研究對(duì)象和方法
　　 對(duì)于半年內(nèi)的體液免疫的研究對(duì)象，入選研究范圍的標(biāo)準(zhǔn)是:2010年3月至2011年6月內(nèi)所有在我中心的地中海貧血患兒行外周血造血干細(xì)胞移植的對(duì)象，在移植后半年的隨訪(fǎng)期間內(nèi)未發(fā)生死亡或

14、排斥，半年時(shí)完成體液免疫的免疫評(píng)估，移植后截止于2012年1月仍無(wú)病存活的病例，病人共有35例。對(duì)其病毒的檢測(cè)與植入證據(jù)檢測(cè)同上。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先采用單個(gè)樣本t檢驗(yàn)對(duì)各個(gè)年齡段的體液免疫與設(shè)定的參考值進(jìn)行比較，患兒年齡，供者年齡與移植后半年內(nèi)體液免疫的恢復(fù)的影響，采用雙變量的Pearson相關(guān)分別分析。P值小于0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　 第二節(jié)：移植后1年的體液免疫的研究對(duì)象和方法
　　 對(duì)于1

15、年內(nèi)的體液免疫的研究對(duì)象，入選研究范圍的標(biāo)準(zhǔn)是:2009年3月至2011年1月內(nèi)所有在我中心的地中海貧血患兒行外周血造血干細(xì)胞移植的對(duì)象，在移植后1年的隨訪(fǎng)期間內(nèi)未發(fā)生死亡或排斥，移植后1年完成體液免疫評(píng)估，移植后截止于2012年1月仍無(wú)病存活的病例。病人共有35例。對(duì)其病毒的檢測(cè)與植入證據(jù)檢測(cè)同上。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單個(gè)樣本t檢驗(yàn)對(duì)各個(gè)年齡段的體液免疫與設(shè)定的參考值進(jìn)行比較。P值小于0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

16、r>　　 結(jié)果：
　　 第一部分：T細(xì)胞亞群的情況
　　 第一節(jié)：移植后半年的T細(xì)胞亞群的恢復(fù)
　　 (1)半年的T細(xì)胞亞群內(nèi)CD3+細(xì)胞的均值1.46×109/L,NK細(xì)胞均值0.33×109/L，CD4+細(xì)胞均值0.25×109/L，CD8+細(xì)胞均值1.14×109/L，其中CD4+細(xì)胞低于設(shè)定參考值0.5×109/L水平(t=-6.874，P＜0.001)。
　　 (2)CMV感染組的半年CD3+

17、、CD8+、CDS+CD28-的細(xì)胞數(shù)分別為1.87±1.47×109/L、1.51±1.27×109/L、1.20±1.13×109/L，明顯高于巨細(xì)胞病毒未感染組，其細(xì)胞數(shù)分別是1.05±0.60×109/L、0.78±0.50×109/L、0.51±0.41×109/L（分別為t=-2.315，P=0.029;t=-2.414，P=0.024;t=-2.540，P=0.018;），其兩組的CD8+CD28-比率分別是46.17％±

18、19.68％，33.32％±12.50％(t=-2.465，P=0.018)。
　　 (3)在CMV感染組內(nèi)，CD8+細(xì)胞與CD8+CD28-細(xì)胞呈線(xiàn)性正相關(guān)(r=0.980，P＜0.001)，而與CD8+CD28+T細(xì)胞數(shù)負(fù)相關(guān)，但無(wú)直線(xiàn)線(xiàn)性相關(guān)(r=0.585，P=0.007)。
　　 第二節(jié)：移植后1年以上的T細(xì)胞亞群的恢復(fù)
　　 地中海貧血患兒在造血干細(xì)胞移植后1年以上T細(xì)胞亞群內(nèi)CD3+細(xì)胞的均值2.2

19、2×109/L，NK細(xì)胞均值0.27×109/L，CD4+細(xì)胞均值0.63×109/L。
　　 第二部分：體液免疫的情況
　　 第一節(jié)：移植后半年的體液免疫恢復(fù)
　　 (1)地中海貧血患兒移植后半年的免疫球蛋白水平，3-6歲的IgA、IgM，IgG的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別是0.40±0.22g/L、0.71±0.35g/L、7.17±2.30g/L，其中IgA、IgM恢復(fù)低于正常同齡兒童水平(分別t=-8.467，P

20、＜0.001;t=-2.305，P=0.042)，＞7歲的IgA、IgM，IgG的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別是0.81±0.71g/L、1.02±0.40g/L、8.13±3.28g/L，均低于正常同齡兒童水平(分別t=-2.305，P=0.042;t=-6.161,P＜0.001;t=-2.733,P=0.019)。
　　 (2)移植后的抗體水平和供者年齡無(wú)關(guān)，但患兒年齡分別與IgA，C3，C4的水平成正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別是0.6

21、67、0.511、0.341，P值分別＜0.001、0.002、0.045。
　　 (3)2例脾切除后的患兒在造血干細(xì)胞移植后半年內(nèi)的IgA、IgM，IgG的平均值分別1.58g/L，0.76g/L，14.25g/L。
　　 第二節(jié)：移植后1年以上的體液免疫恢復(fù)
　　 1年后地貧患兒的3-6歲的IgA，IgG，IgM的均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別是0.83±0.40g/L、9.81±2.92g/L、0.86±0.27g/L，

22、＞7歲的IgA，IgG，IgM的均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別是1.35±0.74g/L、11.45±4.85g/L、1.05±0.53g/L。兩年齡段IgM低于正常同齡兒童(t分別為-8.982，-5.380，P均為＜0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)TM兒童allo-HSCT后半年時(shí)NK細(xì)胞數(shù)比率及CD4+細(xì)胞數(shù)和比率不受CMV感染與否的影響，除了CD4+細(xì)胞數(shù)低于0.5×109/L外，其余均恢復(fù)正常。但一年后的患兒的T細(xì)

23、胞各亞群處于正常參考值水平。
　　 (2)TM兒童allo-HSCT后的巨細(xì)胞病毒感染會(huì)導(dǎo)致高的CD8+細(xì)胞中的CD8+CD28-細(xì)胞的單克隆擴(kuò)增，從而改變T細(xì)胞亞群的之間的轉(zhuǎn)化率，且CD8+細(xì)胞升高比率與CD8+CD28-比率呈直線(xiàn)線(xiàn)性相關(guān)。
　　 (3)對(duì)于TM兒童allo-HSCT后半年時(shí)免疫球蛋白水平均低于正常同齡兒童，除了3-6歲的IgG水平外;同時(shí)患兒年齡與IgA，C3，C4的恢復(fù)成正相關(guān)。
　　 (