山羊誘導性多能干細胞的研究.pdf

1、通過向體細胞中導入特定的轉(zhuǎn)錄因子可以將體細胞重編程為誘導性多能干細胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)。已經(jīng)有很多物種成功地產(chǎn)生相應的iPSCs，但是在有蹄類家畜中，尤其是山羊，iPSCs建系成功的卻很少。本研究主要目的是通過慢病毒攜帶人源的四個多能基因:hOCT4，hSOX2，hKLF4和hcMYC導入山羊體細胞，通過對誘導體系和培養(yǎng)體系的優(yōu)化，成功將山羊體細胞重編程為iPSCs(giPSCs)，在

2、此基礎上，使用同樣的方法將克隆奶山羊體細胞重編程為iPSCs(tgiPSCs)，并且將tgiPSCs作為供體細胞通過核移植技術，檢測其能否在體外生產(chǎn)克隆胚胎。本文主要研究結果如下:
　　1.摸索出適合山羊iPSCs的誘導體系和培養(yǎng)體系
　　本試驗在前人研究成果的基礎上，首先使用干細胞無血清培養(yǎng)體系“KNOCKOUT-DMEM+KSR”分別添加人源白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)，人源

3、Beta-成纖維細胞生長因子(Beta-fibroblastgrowthfactor，β-FGF)，以及兩者都加。試驗結果表明，培養(yǎng)體系中只添加LIF會導致giPSCs自動分化，而添加β-FGF或者兩者都加可以維持giPSCs未分化的狀態(tài)。
　　嘗試家畜ESCs和iPSCs建系經(jīng)常使用的培養(yǎng)基DMEM/F12和血清FBS，通過試驗結果發(fā)現(xiàn)使用FBS對于山羊iPSCs未分化狀態(tài)的維持要優(yōu)于KSR。用形態(tài)學標準選擇形態(tài)好的原代克隆進行

4、擴增，有的克隆重編程效果不好，傳至2～4代克隆會分化。能傳代的克隆，在5代前基本都是用機械法進行傳代。使用酶解法進行傳代，有的克隆比較大，酶解后可以配合機械法，將大的克隆分成小的克隆，輕輕吹打成小的細胞團塊，否則團塊不容易吹開，形成大的細胞團，不利于克隆的形成。
　　2.重編程轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊體細胞產(chǎn)生iPSCs
　　實驗室已經(jīng)成功獲得批量轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊，檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因hLF已經(jīng)很好地整合到這些克隆奶山羊體細胞的基因組中

5、。在已取得成果的基礎上，用轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊耳成纖維細胞作為體細胞，經(jīng)過慢病毒感染進行重編程，成功獲得帶有hLF奶山羊iPSCs(tgiPSCs)。通過檢測發(fā)現(xiàn)，這些tgiPSCs表達干細胞多能基因OCT4，SOX2，cMYC，KLF4和NANOG;對AKP反應呈陽性;可以在體外形成類胚體，形成的類胚體含有三胚層組織;同時可以在裸鼠的體內(nèi)形成畸胎瘤，通過HE染色發(fā)現(xiàn)，形成的畸胎瘤中也含有三胚層組織。
　　3.用tgiPSCs作為核移

6、植供體細胞更有利于核移植胚胎的發(fā)育
　　使用轉(zhuǎn)基因奶山羊皮膚成纖維細胞(tgFs)和轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊耳成纖維細胞誘導產(chǎn)生的iPSCs(tgiPSCs)作為供體細胞，通過核移植技術生產(chǎn)克隆胚胎，分別命名為:tgF-Embryos和tgiPSCs-Embryos，同時收集了山羊體內(nèi)生產(chǎn)的胚胎，命名為:vivo-Embryos，三種胚胎都處于8-16細胞期。使用熒光定量PCR檢測了IGFs家族基因在tgF-Embryos，tgiPSCs

7、-Embryos和vivo-Embryos中的表達情況。結果表明，IGF-1，IGF-1R和IGF-2R三個基因在tgF-Embryos，tgiPSCs-Embryos和vivo-Embryos三種胚胎的8-16細胞階段中的表達量沒有顯著性差異(p＞0.05），但是GF-2在tgiPSCs-Embryos中的表達量要比在tgF-Embryos中的表達量顯著要低(p＜0.01)。然而，IGF-2在tgiPSCs-Embryos和vivo-