誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞正常小鼠耳蝸內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的:
　　利用顯微注射的方法將誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)移植至正常小鼠耳蝸內(nèi),觀察其分化轉(zhuǎn)歸情況,為iPSCs的耳聾治療提供一定的理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1.建立穩(wěn)定的小鼠iPSCs的培養(yǎng)體系,對(duì)穩(wěn)定傳代的小鼠iPSCs進(jìn)行體外鑒定。
　　2.小鼠iPSCs細(xì)胞的標(biāo)記和移植:用CM-Dil染料標(biāo)記iPSCs,流式細(xì)胞儀鑒定標(biāo)記效率。20只正常6-8周齡SPF級(jí)CD-1/ICR鼠隨機(jī)平均

2、分為A、B兩組:A組為試驗(yàn)組,B組為對(duì)照組,將左耳定為試驗(yàn)耳,實(shí)驗(yàn)組移植CM-Dil標(biāo)記的iPSCs,對(duì)照組移植等體積的 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。兩組均在術(shù)前1周和術(shù)后1月對(duì)小鼠左耳行聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)的檢測(cè)。
　　3.miPSCs耳蝸移植后分化細(xì)胞的鑒定:細(xì)胞移植1月后免疫組織熒光染色鑒定移植后的細(xì)胞是否表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志物(MyosinⅦa、Espin)和神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物(Nestin、Neurofilament-M)。
　

3、　4.miPSCs耳蝸內(nèi)移植后用HE染色鑒定是否有畸胎瘤形成。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立了穩(wěn)定的小鼠iPSCs培養(yǎng)體系。穩(wěn)定傳代的小鼠iPSCs經(jīng)AP染色鑒定陽(yáng)性且可形成EBs。
　　2.熒光染料(CM-Dil)對(duì)小鼠iPS細(xì)胞的標(biāo)記效率達(dá)到96.42％。術(shù)前1周, A組、B組ABR反應(yīng)閾分別為24.50±5.50dB SPL、26.00±6.15 dB SPL;A、B兩組術(shù)前1周的ABR反應(yīng)閾比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

4、(p=0.572>0.05)。術(shù)后1月, A組、B組ABR反應(yīng)閾分別為70.50±4.97dB SPL、68.00±5.37 dB SPL;A、B兩組術(shù)后1月的ABR反應(yīng)閾比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.295>0.05)。A、B兩組ABR反應(yīng)閾術(shù)后均較術(shù)前高(p值均<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.A組小鼠耳蝸的內(nèi)外淋巴內(nèi)及蝸軸內(nèi)均可見(jiàn) CM-Dil標(biāo)記的小鼠 iPSCs,并且部分紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志物(Myo

5、sinⅦa、Espin)和神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物(Nestin、Neurofilament-M)。B組耳蝸內(nèi)未見(jiàn)有紅色熒光表達(dá)。
　　4.HE染色鑒定移植miPSCs后耳蝸內(nèi)可見(jiàn)畸胎瘤形成。
　　結(jié)論:
　　1.耳蝸內(nèi)移植后的小鼠iPSCs可以分化為表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞;
　　2.耳蝸內(nèi)移植后的小鼠iPSCs可以分化為表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物的細(xì)胞;
　　2.小鼠iPSCs耳蝸內(nèi)移植后有形成畸胎瘤的可能;
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