細(xì)胞重編程與誘導(dǎo)內(nèi)胚層多能干細(xì)胞的獲取與鑒定.pdf

1、肝臟是人體重要的器官,主要承擔(dān)機體代謝、去氧化、糖原儲存、白蛋白分泌以及膽汁分泌等功能,在毒物藥物代謝中發(fā)揮重要作用。由各種原因引發(fā)的終末期肝病是危害人類健康的重大疾病[1],我國作為肝病大國,這種現(xiàn)象尤為嚴(yán)重。目前針對終末期肝病的唯一有效的治療方式是肝移植,但是供體短缺、移植后免疫抑制劑的長期應(yīng)用所致的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、生活質(zhì)量下降和可能的并發(fā)癥,以及移植手術(shù)本身存在的風(fēng)險都在一定程度上限制了它的應(yīng)用[2]。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展與成熟,細(xì)胞治

2、療已成為終末期肝病治療的一個新選擇[3]。而安全、充足、臨床獲取方便的種子細(xì)胞來源是需要解決的首要問題。目前已經(jīng)嘗試用于臨床治療的種子細(xì)胞包括胎兒或尸體來源的肝細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞,但是,這些細(xì)胞分別存在來源、倫理、分化效率、功能維持、作用機理或免疫排斥等問題,并非臨床應(yīng)用的理想細(xì)胞來源[4]。
　　胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)是具有自我更新和分化全能性的細(xì)胞,理論上可以分化形成機體所有類型的細(xì)胞,因

3、此在重大疾病細(xì)胞治療、藥物篩選、疾病模型建立等方面具有巨大的應(yīng)用潛能。但是由于來源于胚胎發(fā)育囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM),由此而帶來的倫理爭議大大地阻礙了ESC的應(yīng)用。此外,ESC在疾病治療中存在的免疫排斥問題以及形成畸胎瘤的風(fēng)險同樣制約著ESC的應(yīng)用。
　　誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)是通過體細(xì)胞重編程技術(shù)從成體細(xì)胞獲得的類似于ESC的多能性

4、干細(xì)胞。iPSC不但具有和ESC一樣的分化潛能,而且由于來源于病人自體的體細(xì)胞,在克服ESC應(yīng)用的倫理爭議問題的同時,更有利于實現(xiàn)對病人或者疾病的個體化治療。然而,即使目前眾多研究已經(jīng)通過經(jīng)典的重編程方法從幾乎所有的體細(xì)胞獲得了iPSC[5][6],并證實iPSC可向功能性的肝[7]、心肌[8]和血液[9]等功能性細(xì)胞誘導(dǎo)分化,但仍舊無法規(guī)避其在應(yīng)用中重編程效率和誘導(dǎo)分化效率較低,以及成瘤性的風(fēng)險。
　　近年來,越來越多的研究證實

5、通過譜系重編程的方式,可以將終末分化的細(xì)胞進(jìn)行直接轉(zhuǎn)分化,或者去分化成為其祖細(xì)胞,通過這種方式不但可以為臨床應(yīng)用提供足夠的種子細(xì)胞,而且也避免了重編程路徑長、誘導(dǎo)分化譜系雜和成瘤性的風(fēng)險,從而可以為重大性疾病細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用尋找更為理想可控的種子細(xì)胞。因此,我們針對起始細(xì)胞選擇、重編程策略優(yōu)化、小分子化合物引入、重編程目的細(xì)胞鑒定等問題進(jìn)行了系統(tǒng)研究。本論文主要分為兩大部分,在第一部分中,我們利用經(jīng)典的體細(xì)胞重編程方式從人包皮成纖維(

6、human foreskin fibroblast,HFF)細(xì)胞誘導(dǎo)獲得了iPSC,并證實其在體外具有多向分化潛能;在第二部分中,我們通過篩選較為原始、并且與肝臟具有發(fā)育相關(guān)性的消化道上皮干/祖細(xì)胞作為重編程的起始細(xì)胞,實現(xiàn)通過非病毒載體的理化方式獲得誘導(dǎo)內(nèi)胚層多能干細(xì)胞(induced endodermal mutipotent stem cell,iEMSC),再將iEMSC定向誘導(dǎo)分化,獲得功能性肝細(xì)胞,進(jìn)而為包括終末期肝病在內(nèi)的

7、重大性疾病的細(xì)胞治療提供理想的種子細(xì)胞來源。
　　一、利用多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)
　　自2006年日本京都大學(xué)Yamanaka實驗室通過向MEF中導(dǎo)入ESC全能性特異的轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2獲得了iPSC開始[6],目前已經(jīng)有眾多研究通過相似的方法從幾乎所有類型的成體終末分化的細(xì)胞重編程獲得iPSC,并且也可以將iPSC誘導(dǎo)分化獲得功能性的成熟細(xì)胞。iPSC的出

8、現(xiàn),不但為終末期肝病等重大疾病的細(xì)胞治療提供了患者和疾病特異性的種子細(xì)胞,同樣也為干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)的機制研究提供了理想的體外研究模型。所以在本部分研究中,我們利用Yamanaka實驗室的誘導(dǎo)重編程體系建立了本實驗室的iPSC,通過對其造血和成牙分化能力的檢測,證實其具有多向誘導(dǎo)分化潛能。以此建立本實驗室體細(xì)胞重編程機制和臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究平臺。
　　首先我們構(gòu)建了表達(dá)Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2的重組腺病毒載體,并與Y

9、amanaka實驗室的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體分別感染HFF細(xì)胞。通過25天的誘導(dǎo),可以獲得呈克隆樣生長,AP染色陽性的細(xì)胞。將這些細(xì)胞在體外進(jìn)行傳代擴(kuò)增并進(jìn)行驗證,免疫熒光的結(jié)果顯示這些細(xì)胞表達(dá)ESC的全能性標(biāo)志Oct4、Nanog和SSEA-3;通過RT-PCR對內(nèi)源性和外源性基因的檢測結(jié)果證實這些細(xì)胞內(nèi)表達(dá)內(nèi)源性的多能性基因,而外源性多能性基因被很好的沉默,初步證實了獲得的細(xì)胞是iPSC。
　　為了驗證iPSC的體外分化能力,我們將獲

10、得的iPSC和ESC分別與OP9共培養(yǎng)進(jìn)行造血誘導(dǎo)分化,并驗證Wnt3a在此過程中的作用。通過對各個階段的標(biāo)志的流式檢測結(jié)果顯示,在誘導(dǎo)分化第3.75天時,不管是iPSC還是ESC組,與Wnt3a-OP9共培養(yǎng)的實驗組Flk-1+細(xì)胞的比例都較OP9共培養(yǎng)組有明顯的上升,其中iPSC-Wnt3a-OP9組為59.06％,iPSC-OP9組比例為47.11%;ESC-Wnt3a-OP9中為31.91%,明顯高于ESC-OP9的22.88%

11、。在共培養(yǎng)第5天時,同樣在miPSC和mESC-EBs兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中,實驗組CD41+細(xì)胞的比例較OP9共培養(yǎng)組也都有明顯的上升。通過我們的研究,我們首先證實iPSC在體外具有和ESC相同的造血誘導(dǎo)分化能力,同時也證實在ESC和iPSC造血誘導(dǎo)分化早期,Wnt3a可以明顯提高兩者的造血誘導(dǎo)分化效率。
　　同時,通過將iPSC來源的EBs和分離培養(yǎng)的小鼠牙胚間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)并移植于小鼠腎包囊4周后可以觀察到牙芽的形成,RT-P

12、CR結(jié)果顯示牙源性上皮細(xì)胞Msx1、Lhx7、Pax9和Runx2的表達(dá),說明iPSC具有向牙源性上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力。從而證實了iPSC的多向誘導(dǎo)分化能力,為日后iPSC向功能性肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化獲得患者特異性的種子細(xì)胞提供了良好的技術(shù)平臺。
　　二、利用小分子化合物將上皮細(xì)胞譜系重編程獲得誘導(dǎo)內(nèi)胚層多能干細(xì)胞(iEMSC)
　　雖然iPSC保留了ESC的優(yōu)勢并避免了ESC應(yīng)用的倫理爭議和免疫排斥問題,但是iPSC在應(yīng)用中依

13、然存在著重編程路徑長、誘導(dǎo)分化譜系雜和成瘤性的風(fēng)險。此外,大量的外源性基因改造導(dǎo)致的iPSC染色體異常、重編程過程中病毒載體的使用以及低效率等問題都是iPSC在應(yīng)用前有待解決的問題。近兩年,譜系重編程由于具有重編程路徑相對短、誘導(dǎo)分化譜系局限性和不具有形成畸胎瘤風(fēng)險的優(yōu)勢,為解決iPSC應(yīng)用中存在問題提供了可行的突破方案。并且,通過選擇合適的起始細(xì)胞,完全可以實現(xiàn)用更少的轉(zhuǎn)錄因子或者不需要轉(zhuǎn)錄因子和非病毒載體介導(dǎo)的策略實現(xiàn)體細(xì)胞重編程。

14、在本部分研究中,我們選擇患者來源的消化道上皮干/祖細(xì)胞作為起始細(xì)胞,通過較為安全的非病毒載體理化方式,將其重編程為分化能力低于ESC和iPSC的iEMSC。通過對iEMSC的鑒定,證實其為類似于定型內(nèi)胚層(Definitive endoderm,DE)的內(nèi)胚層多能干細(xì)胞。
　　首先,我們對獲得的消化道組織進(jìn)行了組織原位鑒定,發(fā)現(xiàn)在胃竇、十二指腸粘膜、結(jié)腸隱窩等部位存在著表達(dá)CK19、CXCR4、EpCAM、Sox9、Lgr5的上皮

15、干/祖細(xì)胞。通過實驗室建立的原代上皮細(xì)胞分離方法,發(fā)現(xiàn)獲得的上皮干/祖細(xì)胞具有一定分化能力,但是體外的增殖能力非常有限的。根據(jù)丁盛等人的研究,我們對譜系重編程的最佳小分子組合進(jìn)行篩選,并通過最適的小分子組合將消化道上皮干/祖細(xì)胞譜系重編程獲得iEMSC。
　　對iEMSC進(jìn)行增殖能力、表型、基因型和核型的鑒定,結(jié)果顯示iEMSC呈克隆樣生長,具有良好的體外增殖能力;與ESC來源的DE具有相似的細(xì)胞形態(tài),并且表達(dá)DE的特異性標(biāo)志So

16、x17、FoxA2;實時定量PCR結(jié)果顯示iEMSC的基因表達(dá)譜與DE相似,而完全不同于重編程前的消化道上皮干/祖細(xì)胞;對Sox17的啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)較起始細(xì)胞發(fā)生了很大程度的去甲基化;體外分化結(jié)果顯示,獲得的iEMSC可以分化成為肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞、腸道細(xì)胞和膽管細(xì)胞。并對獲得的肝細(xì)胞進(jìn)行體外特異性功能驗證,結(jié)果顯示i-Hep具有正常肝細(xì)胞所具有的生物學(xué)功能。
　　綜上所述,我們的研究表明:由于體細(xì)胞重編程