豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-mRNA的發(fā)掘與鑒定.pdf

1、豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Porcine induced pluripotent stem cells,piPSCs）在畜牧生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)和生物學(xué)基礎(chǔ)研究上具有重要應(yīng)用價(jià)值。但誘導(dǎo)效率低、質(zhì)量差、安全性不明確等限制了piPSCs的廣泛應(yīng)用，歸根結(jié)底是對(duì)干細(xì)胞多能性建立、維持的分子機(jī)制了解不夠。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）廣泛參與細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育調(diào)控，是生命科學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)。關(guān)于lncRNA對(duì)包括piP

2、SCs在內(nèi)的干細(xì)胞多能性建立、維持等有何影響卻鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在揭示piPSCs中l(wèi)ncRNA/mRNA表達(dá)譜，發(fā)掘與piPSCs多能性建立維持密切相關(guān)的lncRNA，以豐富對(duì)豬干細(xì)胞多能性調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為高效創(chuàng)制高質(zhì)量的piPSCs提供依據(jù)。
　　(1)對(duì)piPSCs、豬脂肪干細(xì)胞（Porcine adipose-derived stem cells,pADSCs）和豬耳緣成纖維細(xì)胞（Porcine ear fibro

3、blasts,pEFs）等不同多能性細(xì)胞的lncRNA和mRNA進(jìn)行高通量測(cè)序。pEFs文庫(kù)測(cè)序獲得186,376,840條序列總數(shù)（raw reads），pADSCs文庫(kù)測(cè)序獲得200,812,816條序列總數(shù)，piPSC文庫(kù)測(cè)序獲得166,058,848。經(jīng)質(zhì)量控制程序處理后分別從pEFs、pADSCs和piPSCs文庫(kù)中獲得162,984,884、174,191,150和141,913,112條有效讀取序列。
　　(2)為獲

4、取lncRNA表達(dá)譜及基因組信息，對(duì)piPSCs、pADSCs和pEFs的lncRNA和mRNA轉(zhuǎn)錄組特征進(jìn)行生物信息學(xué)分析。與NCBI上豬參考基因組同源比對(duì)，三個(gè)文庫(kù)共檢測(cè)到36617個(gè)已知mRNA的表達(dá)，其中共表達(dá)32871個(gè)已知mRNA，pEFs、pADSCs和piPSCs分別特異性表達(dá)352、517、531個(gè)已知mRNA；此外，從pEFs、pADSCs和piPSCs各鑒定出8099、8772、8285種已知lncRNA（共105

5、06種），其中特異性表達(dá)的已知lncRNA分別為526種、779種和708種。此外，在7815種不具有編碼蛋白能力的新轉(zhuǎn)錄本中，發(fā)現(xiàn)了4474種新lncRNA，其中共表達(dá)3921個(gè)，pEFs、pADSCs和piPSCs分別特異性表達(dá)10種、26種和49種新lncRNA。
　　(3)piPSCs、pADSCs和pEFs的lncRNA和mRNA差異表達(dá)及GO和KEGG分析。pEFs與pADSCs共有648個(gè)基因差異表達(dá)，其中320個(gè)在

6、pADSCs中上調(diào)表達(dá)，328個(gè)在pADSCs中下調(diào)表達(dá)；pEF與piPSCs共有3640個(gè)基因差異表達(dá)，1825個(gè)在piPSCs中上調(diào)表達(dá)，1815個(gè)在piPSCs中下調(diào)表達(dá)；而pADSCs與piPSCs共有2869個(gè)基因差異表達(dá)，其中1364個(gè)在piPSCs中呈上調(diào)表達(dá)，1505個(gè)在piPSCs中下調(diào)表達(dá)。
　　三種細(xì)胞差異表達(dá)201種已知的lncRNA，其中pEFs與pADSCs差異表達(dá)的已知lncRNA有26種，pADSC

7、s與piPSCs差異表達(dá)的已知lncRNA有137種，pEFs與piPSCs差異表達(dá)的已知lncRNA有184種。此外，三種細(xì)胞中有5種差異表達(dá)的新lncRNA(P＜0.05)，即TCONS_00082347、TCONS_00023643、TCONS_00090231、TCONS_00064109和TCONS_00069653。
　　KEGG分析發(fā)現(xiàn)，pEFs與pADSCs間的差異基因共富集了227個(gè)信號(hào)通路，pADSCs與piP

8、SCs間的差異基因共富集了269個(gè)信號(hào)通路，pEFs與piPSCs間的差異基因共富集了273個(gè)信號(hào)通路。GO分析發(fā)現(xiàn)，pEFs和pADSCs之間的差異基因共富集了4926個(gè)GO功能團(tuán)，pADSCs與piPSCs間的差異基因共富集了8666個(gè)GO功能團(tuán)，而pEFs與piPSCs間的差異基因共富集了9276個(gè)GO功能團(tuán)。多能性相關(guān)的KEGG信號(hào)通路和GO功能團(tuán)中均有差異基因富集。
　　(4)隨機(jī)選取10個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本和10個(gè)lncR

9、NA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，定量PCR結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果基本相符，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄本測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。隨之，利用Blast等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)24種差異表達(dá)lncRNA的靶基因，發(fā)現(xiàn)5個(gè)lncRNA受到in cis作用的靶基因調(diào)控，5個(gè)lncRNA受到in trans作用的靶基因調(diào)控。其中，LOC102166377和LOC102159188的靶基因富集了一些多能性信號(hào)通路，但這兩種lncRNA表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，可能與多能性負(fù)調(diào)控有關(guān)

10、。
　　總之，本研究借助先進(jìn)的高通量技術(shù)對(duì)piPSCs的lncRNA和mRNA聯(lián)合測(cè)序，首次揭示了豬iPSCs中的lncRNA/mRNA表達(dá)譜，不僅新發(fā)現(xiàn)大量lncRNA，而且經(jīng)過(guò)與pEFs、pADSCs相比較，獲得了一些可能與豬iPSCs干細(xì)胞多能性建立、維持密切相關(guān)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)了201種已知lncRNA和5種新lncRNA在三種細(xì)胞間差異表達(dá)，IL-6以及LOC102166377、LOC102159188兩種lncRN