綿羊誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的制作與鑒定研究.pdf

1、2006年，山中申彌利用病毒載體將四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc）感染小鼠體細(xì)胞，獲得了類胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)多潛能性干細(xì)胞（iPS細(xì)胞），為細(xì)胞學(xué)研究提供了新的方向，也為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了廣闊的應(yīng)用前景。動(dòng)物 iPS細(xì)胞的出現(xiàn)對(duì)疾病模型的建立、細(xì)胞治療，種質(zhì)資源的保存、改善體細(xì)胞克隆動(dòng)物的生產(chǎn)效率等方面都有著重要的意義。
　　目的：在無飼養(yǎng)層條件下建立電穿孔轉(zhuǎn)染五因子制備綿羊 iPS細(xì)胞，掌握 iPS細(xì)胞誘

2、導(dǎo)這一技術(shù)，為進(jìn)一步研究細(xì)胞重編程機(jī)制及未來 iPS細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1本實(shí)驗(yàn)采用組織培養(yǎng)法，雙酶法分離出中國(guó)美利奴成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2將含有人的 Oct4；Sox2、Klf4；l-Myc、lin28基因的3個(gè)質(zhì)粒，分別采用4-D電轉(zhuǎn)染儀中 EH-100，EN-150，CZ-167，CA-137四個(gè)電轉(zhuǎn)程序轉(zhuǎn)染到綿羊成纖維細(xì)胞中，篩選出最適合綿羊成纖維細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染程序；細(xì)胞密度和質(zhì)粒濃度均相同，質(zhì)粒濃度

3、不同對(duì) AP染色陽性（AP+）克隆的影響；細(xì)胞密度，質(zhì)粒濃度均一致，質(zhì)粒比例不同，對(duì) AP+克隆的影響；細(xì)胞密度，質(zhì)粒濃度，質(zhì)粒濃度均一致，培養(yǎng)液中有無添加Vc，對(duì) AP+克隆的影響，以選出最適合制備 iPS的方案。3通過外形觀察、定量 PCR、免疫熒光染色、轉(zhuǎn)錄組分析等來檢測(cè)所制備的綿羊類 iPS細(xì)胞。
　　結(jié)果與結(jié)論：（1）雙酶法快速成功分離出中國(guó)美利奴綿羊耳源成纖維細(xì)胞，為重編程的提供優(yōu)良的體細(xì)胞。（2）采用 EH-100電

4、轉(zhuǎn)程序，細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，質(zhì)粒比例1:1:1，質(zhì)粒質(zhì)量濃度為0.1 mg/L，培養(yǎng)液中添加0.05 mg/L Vc條件下，AP染色陽性（AP+）克隆形成率達(dá)14％，優(yōu)化的電轉(zhuǎn)染的方法和培養(yǎng)方案有效提升了綿羊類誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的制備效率。（3）在無飼養(yǎng)層條件下，通過電轉(zhuǎn)染法將五因子導(dǎo)入綿羊耳源成纖維細(xì)胞，并成功重編程為類 iPS細(xì)胞，在外觀形態(tài)、多能基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄組等方面的鑒定結(jié)果都表明其具有多潛能性，為以后進(jìn)一步研究綿羊