綿羊胚胎干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定及誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、許多物種的ES細(xì)胞在建系和培養(yǎng)過(guò)程中多存在傳代、保存難和易分化等問(wèn)題，且對(duì)其誘導(dǎo)分化及調(diào)控機(jī)理也知之甚少，特別是家畜ES細(xì)胞的研究進(jìn)展緩慢。綿羊ES細(xì)胞的研究雖早有報(bào)道，但仍未建立可穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系，其發(fā)育調(diào)控機(jī)制尚屬空白。為此，本研究以內(nèi)蒙古優(yōu)勢(shì)畜種綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，建立并優(yōu)化了其類(lèi)胚胎干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)體系，對(duì)獲得的綿羊類(lèi)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的誘導(dǎo)分化研究，主要結(jié)果如下：
　　1.建立并優(yōu)化了綿羊卵母細(xì)胞體

2、外受精發(fā)育培養(yǎng)體系。添加10%～15% ESS、10μg/mL FSH、20μg/mL LH、1.5μg/mL17-βE2、100 IU/mL青霉素和100 IU/mL鏈霉素的TCM-199培養(yǎng)液能較好地促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟。綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)22～24h，用附睪精液進(jìn)行體外受精，用Sofaa，10%FBS高糖Sofaa組合或CM，BM組合的發(fā)育液培養(yǎng)，置于38.5℃、三氣(5%CO2、5%O2、90%N2)、飽和濕度的條件下

3、，可獲得較高的卵裂率(76.0%)和囊胚率(31.1%)。
　　2.建立了綿羊類(lèi)ES細(xì)胞的分離體系。SEF、MEF及兩者的1:1混合細(xì)胞都可較好地支持綿羊類(lèi)ES細(xì)胞的生長(zhǎng)。在不具備獲得體內(nèi)胚的條件下，體外受精胚可替代體內(nèi)胚用于類(lèi)ES細(xì)胞的分離，同樣也具有較好的增殖及傳代能力。囊胚的質(zhì)量和胚齡影響綿羊類(lèi)ES細(xì)胞的貼壁及增殖。機(jī)械切割（半胚法）處理囊胚，可獲得跟免疫法相近的ICM貼壁率（46% VS53.6%）。
　　3.建立了

4、綿羊類(lèi)ES細(xì)胞的培養(yǎng)體系，獲得的類(lèi)ES細(xì)胞體外培養(yǎng)傳代達(dá)到了20代。機(jī)械法結(jié)合酶消化法適合于綿羊類(lèi)ES細(xì)胞的分離與傳代。添加一定濃度的FBS、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素及VC的DMEM高糖培養(yǎng)液可促進(jìn)類(lèi)ES細(xì)胞的增殖，適于綿羊類(lèi)ES細(xì)胞的培養(yǎng)。培養(yǎng)獲得的綿羊類(lèi)ES細(xì)胞，具有ES細(xì)胞的典型特征，AKP染色呈陽(yáng)性，表達(dá)Kit、Rex1、Sox2、Nanog和Oct4基因，OCT4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA

5、-1-81特異性蛋白，染色體倍性正常（2n=54），在體外可自發(fā)分化為囊狀體及各胚層的細(xì)胞，具有ES細(xì)胞的自我更新和分化特性。
　　4.建立了綿羊類(lèi)ES細(xì)胞體外分化培養(yǎng)體系。在誘導(dǎo)液中添加一定濃度的維甲酸或維甲酸與bFGF、Insulin聯(lián)合使用，可將綿羊類(lèi)ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性基因和蛋白（β-TubulinⅢ和Nestin）；添加β-甘油磷酸鈉、DEX及VC鹽的誘導(dǎo)液，可將綿羊類(lèi)ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞

6、，經(jīng)AKP、茜素紅和Kossa染色為陽(yáng)性。添加DMSO或DMSO與RA聯(lián)合使用的誘導(dǎo)液，可將綿羊類(lèi)ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞，其表達(dá)心肌特異性基因 NKX2.5和 GATA4及特異性蛋白α-Actin；脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液可促使綿羊類(lèi)ES細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，油紅染色為陽(yáng)性；添加一定濃度的ITS、EGF和NA的誘導(dǎo)液，可促使綿羊類(lèi)ES細(xì)胞分化為胰島分泌細(xì)胞，且表達(dá)特異性基因Insulin和PAX4及特異性蛋白Insulin。即綿羊類(lèi)ES可誘導(dǎo)