多能性干細胞誘導與體外培養(yǎng)的初步研究.pdf

1、誘導多能性干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)是通過導入四個轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等組合,使分化的體細胞進行重編程從而獲得一類與胚胎干細胞具有相似特性的新細胞類型。由于iPS細胞同樣具備與胚胎干細胞類似的無限增殖、多向分化潛能以及自我更新維持等能力,利用病人自身細胞獲得的iPS細胞能減少免疫排斥反應,且它能夠很好的避開ES細胞面臨的倫理道德問題,因而iPS技術在動物模

2、型的建立、藥物篩選以及疾病治療等領域具有廣闊的應用前景。為探討以耳聾病人體細胞誘導獲得iPS細胞的可行性,本論文開展了如下三個方面的研究:
　　1.小鼠MEF誘導成多能性干細胞技術體系優(yōu)化:探討通過一種低效的誘導體系,誘導 P53基因敲除以及野生型的小鼠胚胎成纖維細胞,獲得iPS細胞,進而分析二者Dlk1-Dio3區(qū)基因表達差異,研究P53信號通路與Dlk1-Dio3區(qū)在體細胞重編程機制作用上可能存在的關聯(lián)性。結(jié)果表明:以四個多潛

3、能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4以及c-Myc為組合,用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,介導 P53基因全敲型小鼠胚胎成纖維細胞,在一個低效的誘導體系下,獲得的小鼠細胞集落AP染色呈弱陽性,為不完全重編程的iPS細胞。而通過慢病毒載體介導,能成功誘導P53+/-小鼠胚胎成纖維,獲得的iPS細胞,AP染色呈陽性。RT-PCR檢測到內(nèi)源多能性四因子Oct4、Sox2、Klf4及 c-Myc的表達。免疫熒光染色能檢測到多能性相關的細胞核、細胞膜蛋白O

4、CT4、NANOG和SSEA-1等的表達。
　　2.利用非整合Episomal質(zhì)粒誘導耳聾病人體細胞獲得多能性干細胞的初步研究:探討應用非整合質(zhì)粒系統(tǒng)獲得病人iPS細胞的可行性。結(jié)果顯示:病人皮膚組織塊原代培養(yǎng)第7天,可觀察到大量細胞從人耳皮膚組織邊緣向外延伸,呈典型的成纖維細胞特征。利用非整合Episomal質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病人耳皮膚成纖維細胞,電轉(zhuǎn)后第5天能明顯觀察到細胞的形態(tài)由原先的梭形慢慢變圓,第15天能觀察到一個孔中已出現(xiàn)大量不

5、規(guī)則的圓形或橢圓形扁平狀的細胞集落,能明顯與集落周圍的成纖維細胞區(qū)分開。取第3代次的人iPS細胞進行堿性磷酸酶染色,可觀察到細胞集落被染成深紫色,表現(xiàn)為AP陽性,而對照飼養(yǎng)層細胞則未被著色,呈AP陰性。以人胚胎干細胞H9作為陽性對照組,取第3代的人耳皮膚成纖維細胞誘導的iPS細胞,用小鼠、大鼠、兔子來源的OCT-4、NANOG、SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1抗體作為一抗,經(jīng)過免疫熒光染色后觀察顯示:人iPS細胞表達人胚胎多能性

6、干細胞細胞核蛋白OCT-4、NANOG以及細胞膜蛋白SSEA-3、SSEA-4。未檢測到小鼠多能性干細胞特異性膜蛋白SSEA-1的表達。細胞用Hochest33342染細胞核,觀察到多能性核蛋白OCT-4、NANOG能與Hochest33342染的細胞核重合;而多能性細胞細胞膜特異性表達的SSEA-3、SSEA-4分布在Hochest33342染的細胞核周圍,呈網(wǎng)格狀分布;未能在 iPS克隆上觀察到小鼠多能性干細胞特異性的SSEA-1的

7、表達。證明了本實驗電轉(zhuǎn)得到的iPS細胞來源于人耳皮膚成纖維細胞,并非小鼠胚胎成纖維細胞。
　　3.通過在293T細胞、小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)、人間充質(zhì)干細胞（MSC)、人胚胎干細胞(人 ESC)等不同類型細胞的培養(yǎng)液中添加Selleckchem公司生產(chǎn)的支原體去除試劑,最終確定該試劑的作用效果。
　　結(jié)論:以四個多潛能性轉(zhuǎn)錄因子OSKM為組合,用慢病毒載體比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體更容易誘導P53基因全敲型小鼠胚胎成纖維細胞為i