體外臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及其向肝細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的初步研究.pdf

1、目的：從臍血中提取間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行體外擴(kuò)增，摸索臍血間充質(zhì)干細(xì)胞在體外的適宜培養(yǎng)環(huán)境。探討間充質(zhì)干細(xì)胞在體外分化為肝細(xì)胞的可能性和適宜條件。 方法： 1.待胎兒娩出斷臍后，無菌條件下采血，并用肝素抗凝。使用相對密度為1.077的ficoll淋巴細(xì)胞分離液，利用密度梯度離心原理分離臍血單個(gè)核細(xì)胞。 2.貼壁培養(yǎng)法，比較不同接種密度、不同血清濃度條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁情況。從而摸索臍血來源間充質(zhì)干細(xì)胞的適宜培養(yǎng)

2、環(huán)境。 3.收集4代的細(xì)胞，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面CD29、CD44、CD34、CD45的表達(dá)情況，來鑒定細(xì)胞表面的標(biāo)志物。 4.常規(guī)方法凍存和復(fù)蘇間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察復(fù)蘇后細(xì)胞的生長情況。 5.收集4-8代的細(xì)胞，分成5個(gè)誘導(dǎo)組。分別采用與正常肝細(xì)胞株LO2分層共同培養(yǎng)法、細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)法及細(xì)胞因子階段誘導(dǎo)法，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。 6.采用RT-PCR，檢測白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)及角質(zhì)

3、蛋白(CK19)mRNA的表達(dá)情況，來鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化情況。 結(jié)果： 1.108/ml的接種密度，7d后首次換液，可獲得較大密度的間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)體外生長增殖。 2.5％的血清，細(xì)胞不易貼壁、增殖緩慢。10％-15％的血清，有利于干細(xì)胞的生長增殖，且不易發(fā)生形態(tài)變化。20％的血清，細(xì)胞生長快，但易發(fā)生形態(tài)改變。 3.流式細(xì)胞技術(shù)分析：CD29(+)、CD44(+)、CD34(-)、CD45(-

4、)，與間質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的的特點(diǎn)一致。RT-PCR分析：間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)ALB、AFP及CK19。 4.本實(shí)驗(yàn)所獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳8代后，細(xì)胞增殖能力明顯減弱，體積變大，呈不規(guī)則形。第10代時(shí)，無法繼續(xù)傳代，細(xì)胞死亡。復(fù)蘇后，間充質(zhì)干細(xì)胞要經(jīng)歷1w的平臺期后，才能逐漸恢復(fù)凍存前的狀態(tài)。 5.第1誘導(dǎo)組(與LO2共同培養(yǎng))、第2誘導(dǎo)組(A組誘導(dǎo)液)、第3誘導(dǎo)組(與LO2共同培養(yǎng)+A組誘導(dǎo)液)誘導(dǎo)6w，較對照組未見

5、形態(tài)學(xué)變化，也未檢測到ALB、AFP及CK19mRNA的表達(dá)。 6.第4誘導(dǎo)組(B組誘導(dǎo)液)誘導(dǎo)6w,細(xì)胞形態(tài)也未有改變，未檢測到ALB、AFP及CK19mRNA的表達(dá)。 7.第5誘導(dǎo)組(C組誘導(dǎo)液)誘導(dǎo)4w，細(xì)胞由長梭型變?yōu)槎嘟切危琑T-PCR檢測到AFPmRNA的陽性表達(dá)，繼續(xù)誘導(dǎo)2w后，檢測到AFPmRNA、ALBmRNA、CK19mRNA的陽性表達(dá)。但細(xì)胞死亡較多，增殖能力差，細(xì)胞密度減少明顯。 結(jié)論：

6、 1.臍血中含有間充質(zhì)干細(xì)胞，但含量少，不同個(gè)體之間也存在生物學(xué)差異。臍血MSCs貼壁較骨髓MSCs晚，體外培養(yǎng)困難。要想實(shí)現(xiàn)體外擴(kuò)增，需要高密度接種、較高的血清濃度，以10.15％為宜。但血清濃度也不能過高，過高的血清濃度(>20％)促進(jìn)細(xì)胞分化，增殖能力明顯降低。 2.體外培養(yǎng)的MSCs，傳代能力有限，P4-P8代細(xì)胞活力好。P10代細(xì)胞死亡，目前尚無法實(shí)現(xiàn)MSCs的體外無限增殖。凍存后的MSCs，復(fù)蘇后，生長緩慢，需